关于印发手性药物质量控制研究等4个技术指导原则的通知

法规君

关于印发手性药物质量控制研究等4个技术指导原则的通知
国食药监注[2006]639号

各省、自治区、直辖市食品药品监督管理局（药品监督管理局）：
　　为科学规范和指导药物研究工作，保证药物研究质量，国家局组织制定了《抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则》、《手性药物质量控制研究技术指导原则》、《药物生殖毒性研究技术指导原则》和《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》等4个研究技术指导原则，现予发布，请参照执行。

　　附件：1．抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则?
　　　　　2．手性药物质量控制研究技术指导原则?
　　　　　3．药物生殖毒性研究技术指导原则?
　　　　　4．细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则

　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　国家食品药品监督管理局
　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　二○○六年十二月十九日

附件一

抗HIV药物非临床药效学研究

技术指导原则

抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则

一、   概述

艾滋病的全称是“获得性免疫缺陷综合征”（Acquired immunodeficiency syndrome，AIDS），它是由艾滋病病毒，即“人类免疫缺陷病毒”（Human immunodeficiency virus，HIV）感染而导致的一种传染性疾病。

HIV在分类学上属于逆转录病毒科 (Retroviridae)、慢病毒属 (Lentivirus)、灵长类慢病毒群 (Primate lentivirus group)。HIV分为二型：HIV-1和HIV-2。HIV-1为全球性流行，HIV-2主要流行于非洲少数国家。HIV-1较HIV-2 有更强的传播和致病能力。由于目前的研究和治疗经验主要针对HIV-1，本指导原则主要涉及抗HIV-1的药物。根据目前的认识，HIV感染人体的靶细胞是免疫系统的CD4+淋巴细胞，HIV的复制过程分为融合进入、基因逆转录、基因整合、基因表达、病毒组装及释放等阶段，抗HIV药物研究的靶点主要针对上述几个阶段。

本指导原则介绍了抗HIV药物非临床药效学研究的一般原则和主要内容，还收载了抗HIV体内外药效学研究的一般方法等，供研发者参考。本指导原则主要涉及抗HIV的化学药物，不包括中药、生物制品、预防用药和免疫调节剂等。

本指导原则根据目前的认知提出一些观点和建议，旨在引导和推动我国该类药物非临床药效学研究与评价的发展，并帮助研发者理解对临床试验和/或临床应用有重要意义的数据，并非强制性要求。研发者可根据品种的具体特点和基础研究情况，采用其他适宜的方法，但应对采用的方法及其可靠性进行说明。

二、   一般原则

1、不同的抗HIV药物作用机制不同，各有特点，可根据具体情况确定药效学研究的内容和顺序。

2、体外药效学研究是阐明药物具有抗HIV作用的基础，是抗HIV药物研究与评价的基本内容。

3、体内药效学研究对于进一步说明药物的抗病毒作用、指导临床试验有重要的参考价值。

4、应阐明药物作用的主要靶点或病毒复制的阶段，在此基础上鼓励进行深入的作用机制研究。

5、HIV具有高度的变异性，极易产生耐药性。耐药性研究有助于确定药物的临床适用范围，鼓励进行该项研究。

6、联合用药的体外药效学研究对抗HIV药物的临床应用配伍有一定的提示作用，可视具体情况考虑进行此项研究。

三、   主要研究内容

1、   体外药效学研究

HIV可以在体外细胞培养系统完成复制周期。在进行临床试验前，应对药物和/或其主要代谢产物进行可定量的体外抗病毒活性研究，以证明药物的抗病毒效果，从而支持药物进入临床试验。体外抗病毒活性研究得到的剂量－效应关系可以指导临床试验剂量的选择。由于HIV具有高度的变异性，体外抗病毒活性研究应使用具有代表性的HIV毒株，特别是应在原代人外周血单个核细胞（Peripheral blood mononuclear cells,PBMC）/HIV 临床分离株培养系统中验证其抗HIV活性。

体外药效学试验需要首先确定一个没有细胞毒性的药物浓度，以便在细胞培养模型上区分药物的抗病毒活性和药物导致的细胞死亡。应在药物浓度逐渐增加的情况下使用定量试验测定HIV复制的情况并与没有药物存在的情况进行比较。治疗指数（Therapeutic index,  TI）是评价药物体外抗HIV活性的最重要指标。体外药效学研究就是要在不同细胞培养系统中，测定药物对HIV临床分离株和实验室适应株的抗病毒活性，分别计算出治疗指数。具体试验方法可参考附录中的相关内容。

药物对HIV的有效抑制浓度应与作用机理提示的数据一致。如果药物抑制HIV复制的浓度低于作用机理研究所提示的浓度，提示可能存在其他作用靶点或机理。

血清蛋白可以结合并屏蔽很多药物，从而影响药物的抗病毒活性。建议对血清蛋白结合率高的药物进行血清蛋白存在情况下的体外抗病毒活性研究。

联合用药是目前临床抗HIV治疗的基本原则，主要目的是减少或延缓耐药性毒株的产生。推荐与已经上市的、具有不同作用机理、作用靶点和代谢特征的药物进行联合抗病毒活性研究，这对于确定临床联合用药方案具有一定的提示作用。

2、   体内药效学研究

目前尚缺乏理想的HIV感染动物模型，但体内药效学研究对于进一步说明药物的抗病毒作用、指导临床试验仍有重要的参考价值。目前可供评价抗HIV药物体内有效性的动物模型主要有二种：（1）猴艾滋病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）感染模型：SIV与HIV-1、HIV-2同属慢病毒，可感染恒河猴、食蟹猴等。该模型既可考察药物在体内对病毒复制的抑制作用，又可观察给药后免疫功能重建的情况。（2）人淋巴组织重建的严重联合免疫缺陷小鼠模型（Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu）：将人外周血淋巴和单核细胞或胸腺组织移植给SCID小鼠，然后感染HIV。

尽管SIV感染模型与人艾滋病感染的病毒不同，其发病机理、临床表现、病毒学及免疫学特征等也有差异，但SIV和HIV均属于逆转录病毒科慢病毒亚科，有较高的核苷酸序列同源性，具有相同的生活周期。SIV可选择性地攻击猴的CD4+细胞，猴感染SIV后出现与人艾滋病相似的发病过程和病理特征，是目前用于评价抗HIV药物相对较好的动物模型。SCID-hu小鼠模型也可用于抗HIV药物的体内药效学研究，但需严格的饲养条件。

动物感染模型给药后观察的指标包括：（1）病毒学指标：病毒滴度、病毒抗原量以及病毒载量，耐药性病毒的分离和鉴定等。（2）免疫学指标：CD4+/ CD8+细胞数、淋巴细胞功能等。（3）临床指标：症状、发病率和死亡率。（4）组织病理学指标： 组织病理学变化。具体试验方法可参考附录一中的相关内容。

3、作用机理研究

由于目前尚缺乏理想的HIV感染动物模型，体外抗病毒活性与人体内实际情况的相关性又具有一定的局限性，作用机理研究对于进一步阐明药物的抗HIV作用、确定药物的临床治疗定位和联合用药方案具有重要的意义，对预测药物的毒性和阐明耐药产生的机理也是有价值的。作用机理研究包括：（1）确定药物特异性抑制病毒复制或病毒特定功能的能力。（2）确定药物作用的靶点，例如：病毒融合进入、逆转录酶、整合酶、蛋白酶等。

除上述基本的机理研究以外，还可以采用生物化学、结构学、细胞学、遗传学等方法进一步研究药物对病毒的受体结合、酶活性、结合活性、蛋白剪切加工、病毒颗粒装配等方面的作用；测定药物的X－射线晶体结构、分析作用靶点的耐药性基因变异特征等。另外还应通过对病毒和细胞/宿主蛋白靶点的研究证明药物作用的特异性，特别是在细胞内有病毒酶类似物存在的情况下。例如，如果药物作用于HIV多聚酶，相对于宿主细胞的DNA多聚酶（例如DNA多聚酶α, β, γ），药物对HIV多聚酶的活性应更为显著。

4、耐药性研究

鼓励创新性抗HIV药物进行耐药性研究。在研究中应重点关注两方面的问题：一方面是药物对HIV耐药毒株是否有抗病毒活性，另一方面是药物是否容易诱导病毒产生耐药性以及耐药性毒株的基因型和表型耐药性特性。

四、   结语

非临床药效学研究与评价是抗HIV药物评价的重要组成部分，对于该类药物的临床试验与临床定位有重要的提示价值。在尚无理想的动物模型的情况下，应更加重视体外药效学研究与评价。鼓励进行体内药效学研究，尽可能提供有提示价值的相关研究资料。

抗HIV药物非临床药效学研究应按照药物研发的客观规律分阶段持续地进行，在进行临床试验前提供必要的、足够的有效性提示信息，在临床试验和临床应用过程中还应根据实际情况和需要进行深入研究。

由于抗HIV药物研究与评价是一项不断发展和探索的课题，本指导原则也将随着研发和认知水平的提高不断修订和完善。

五、   参考文献

1、   FDA：Guidance for Industry：Antiviral Drug Development — Conducting Virology Studies and Submitting the Data to the Agency（DRAFT GUIDANCE）. 2005.5

2、   FDA：Guidance for Industry：Role of HIV Drug Resistance Testing in Antiretroviral Drug Development(DRAFT GUIDANCE）.2004.12

3、   抗人免疫缺陷病毒（HIV-1）药药效学指导原则草案，蒋岩等，1999

4、   中药新药治疗艾滋病非临床有效性研究与评价专题会纪要，药审中心，2005.3

六、   著者

《抗HIV药物非临床药效学研究技术指导原则》课题研究组

附录一：

抗HIV药物非临床药效学研究的一般方法

HIV可用传代人T淋巴细胞或原代人外周血单个核细胞培养，T嗜性的病毒株可导致人T淋巴细胞出现特征性细胞病变，如细胞融合、多核巨细胞等。M嗜性的病毒株一般不导致细胞病变，可通过检测培养上清液的HIV p24抗原、病毒RNA或逆转录酶活性监测病毒复制的情况。体外药效学试验一般应重复三次。

目前尚缺乏理想的HIV感染动物模型，常采用替代模型或经过改造的小动物模型来评价药物的体内抗HIV活性，如感染猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus，SIV）或嵌合病毒（Simian/human immunodeficiency virus ，SHIV）的猴模型和感染HIV的人淋巴组织重建的严重联合免疫缺陷小鼠模型(Sever combined immunodeficient-human，SCID-hu)。

本附录收入了目前较成熟和常用的抗HIV体外、体内药效学试验方法，供研发者参考。今后可根据研究进展情况进一步修订。

一、体外药效学试验

1、病毒和细胞

（1）病毒：应尽可能选择多种生物学表型和基因型的病毒株，包括HIV实验室适应株和有代表性的HIV临床分离株。在进行抗HIV耐药性毒株的药效学研究时，应选用耐药性毒株；对于明确作用靶点的药物，应首先选择对该作用靶点药物耐药的毒株。

（2）细胞：应尽可能选择多种细胞。常用的有传代人T淋巴细胞系（如CEM、MT4、MT2、C8166、H9等）、单核巨噬细胞系（如U937等）和活化的人原代外周血单个核细胞（PBMC）。

（3）病毒感染剂量的确定：测定HIV的感染剂量一般采用在96孔细胞培养板上微量培养滴定的方法，通过观察细胞病变或检测病毒标记物，如HIV p24抗原或逆转录酶等，计算出病毒的感染性滴度（半数组织培养感染剂量，50% Tissue culture infectious dose， TCID50）。在不同的细胞系/病毒株培养系统，使用的病毒感染剂量不尽相同，一般选用100～1000TCID50。

2、药物的细胞毒性测定：将不同浓度的药物加入细胞培养板中，在特定条件下培养一定时间，用适宜的方法测定活细胞的比例，计算药物对细胞的毒性（半数细胞毒性浓度，Median toxic concentration，TC50）。

3、抗HIV活性测定：

（1）试验分组

空白对照组：正常培养的细胞。

阳性对照组：阳性对照药与病毒和细胞共同培养。阳性对照药一般选择与受试药物作用靶点相同的临床有效药物。

阴性对照组：药物溶媒与病毒和细胞共同培养。

病毒对照组：病毒和细胞共同培养。

药物对照组：受试药物与细胞共同培养。

试验组：受试药物与病毒和细胞共同培养。

（2）感染和给药方法：一般采用药物、病毒、细胞同时培养的方式，也可以根据药物作用的靶点采取药物先与HIV作用再加细胞、药物先与细胞作用再加HIV或HIV先感染细胞再加药物的感染和给药方式。

（3）监测指标和方法：

细胞病变：在显微镜下观察细胞的形态，观察有无HIV特征性的细胞病变（合胞体以及细胞融合）。

HIV抗原：用ELISA方法检测培养上清液中的HIV p24 抗原浓度。

逆转录酶：用同位素掺入或其他方法检测培养上清液的逆转录酶活性。

根据细胞病变观察、p24抗原或逆转录酶检测的结果，计算药物对病毒的抑制活性（半数抑制浓度，Median inhibition concentration,  IC50）。

4、药效学评价指标

由于病毒的存活与复制依赖于宿主细胞，而抗病毒药物本身有一定的细胞毒性，因此不能仅以细胞病变、p24抗原或逆转录酶活性作为药效学评价的指标，而应以治疗指数（TI）为主要的评价指标。一般认为治疗指数大于10的药物可能具有体外抗HIV活性。

5、药物的联合抗HIV活性测定

将2～3种不同的药物加入到同一实验体系中，按照前述的方法监测病毒的抑制情况，判断药物对病毒的联合作用。实验中除了设置一般体外药效学研究需要的对照以外，还应有各单药对照。联合抗HIV活性测定的数据分析方法比较复杂，需采用特定的模型和软件。

二、体内药效学试验

1、SIV感染猴模型

（1） 病毒：SIV毒株，静脉注射或粘膜感染。

（2） 动物：恒河猴、食蟹猴等，体重5公斤左右，动物数应满足评价的要求，一般每组4～6只。

（3） 病毒感染剂量的测定：可采用两种方法，一种方法是用保存的毒种在体外感染猴淋巴细胞，初步确定病毒的感染剂量。一般选择三个剂量组，每组间10倍稀释，每个稀释度接种两只猴，感染后不同时间取血，通过细胞培养测定病毒滴度，并定量检测SIV RNA，以两只猴均感染的最小剂量作为最小感染量（Monkey infectious dose，MID100）。另一种方法是用感染猴的血浆接种猴，感染后每周取血测定SIV抗原和细胞培养病毒，计算半数感染量（Median infectious dose, ID50）。

（4） SIV感染猴治疗试验：

急性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID50 或5MID100 的SIV，同时或4小时后口服或注射最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量的药物，每天给药，连续8周。每周取血，培养病毒，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天和停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD4+、CD8+细胞数和CD4+/ CD8+比值。

慢性感染治疗试验：猴静脉注射10～100ID50或5～10MID100 的SIV，感染后60天左右开始给药，一般试验组在最大无毒剂量以下2倍递减2个剂量。每天给药，连续8周。于给药前、给药第8周、停药当天和停药后8周取血，测定SIV p27抗原滴度和SIV RNA，计算保护百分率，并与病毒对照组进行比较。给药前、停药当天、停药后8周进行淋巴结检查，观察免疫系统的病理改变。另外，还要测定CD4+、CD8+细胞数和CD4+/ CD8+比值。

2、HIV感染SCID-hu小鼠模型

（1）动物：SCID小鼠，4～8周龄，雌性，静脉注射人PBMC或移植人胚胸腺/肝脏组织。

（2） HIV感染剂量测定：将HIV细胞培养上清液10倍连续稀释5个浓度，静脉注射或移植组织注射感染小鼠。1周后取小鼠的血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算ID50。

（3）药物毒性测定：SCID-hu小鼠灌服或静脉注射给药，测定急性毒性和亚急性毒性，计算半数致死量（Median lethal dose, LD50）和最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）。

（4）HIV感染SCID-hu小鼠药物治疗试验：SCID-hu小鼠腹腔注射10～100ID50 HIV，2～24小时后灌服或静脉注射给药。感染1周后，取血液、脾、淋巴结和腹腔洗液，定量培养，测定病毒滴度，HIV p24抗原、病毒载量，计算抑制率和半数有效剂量（Median effective dose, ED50），并与病毒感染对照组进行比较。

附录二：

耐药性研究的相关问题

考察药物对HIV耐药性毒株是否有抗病毒活性，至少应该评价对相同作用靶点的耐药性毒株的抗病毒活性，所选用的耐药性毒株应该经过全面的鉴定。由于抗HIV药物已经有很多种，交叉耐药性是临床上的一个重要问题，因此应关注药物对于相同作用靶点有耐药性的病毒的抗病毒活性，及已上市药物对受试药物诱导的耐药毒株的抗病毒活性。耐药毒株的试验结果可提示药物用于该类耐药株的临床有效性。

考察药物是否容易导致病毒产生耐药性以及耐药性毒株的生物学特性，可在体外进行耐药毒株的诱导试验，以确定药物是否容易导致病毒产生耐药性以及耐药性毒株的基因型和表型特征，并检验交叉耐药性。

有些药物的遗传阈值比较低，病毒基因发生1～2个点突变就可产生耐药性，而有些药物的遗传阈值比较高，需要多个基因位点的突变才能产生耐药性。可采用两种方法诱导药物的耐药毒株：（1）病毒在固定的药物浓度下连续传代，可使用多个不同药物浓度的培养系统，这种方法对于遗传阈值低的药物比较有效；（2）病毒在逐渐增加药物浓度的情况下连续传代培养，药物浓度从IC50值的一半起始，监测病毒复制的情况并诱导出耐药毒株。

用基因型和表型方法对诱导出的耐药毒株进行鉴定。基因型分析可以确定哪些基因突变导致HIV对药物的敏感性下降，主要方法是对HIV基因组中药物作用的靶基因进行核酸序列测定，并与野生毒株的靶基因序列进行比较。对传代过程中不同代次的毒株进行序列测定可确定多个突变出现的先后顺序。表型耐药性分析能够确定突变的病毒是否对药物的敏感性下降以及下降的程度。耐药性相关基因突变的确定有助于使用重组病毒系统评估这些突变导致的表型耐药性，也就是使用定点诱变系统或PCR方法扩增病毒基因组相应的部分引入这些特定的突变，以便检测重组病毒在体外对药物的敏感性；也可以采用在含有不同浓度药物的培养基中培养的方法，通过测定HIV抗原、HIV RNA、HIV逆转录酶、细胞毒性或报告基因的表达等确定IC50值并与参考毒株的IC50进行比较，以IC50增加的倍数作为衡量表型耐药性的指标。

附录三：

名词解释

半数组织培养感染剂量（50%Tissue culture infectious dose ,TCID50）：是使50%细胞感染的病毒稀释度。

半数有效量（Median effective dose）：是能引起50%阳性反应或50%最大效应的浓度或剂量，分别用半数有效浓度（EC50）、半数抑制浓度（IC50）或半数有效剂量（ED50）表示。如果效应指标为毒性或死亡，则可改为半数毒性浓度（TC50）、半数毒性剂量（TD50）或半数致死浓度（LC50）、半数致死剂量（LD50）表示。

治疗指数（Therapeutic index, TI）：药物诱导细胞死亡的效力与抑制病毒复制的效力的比值（50%细胞毒性浓度/50%有效抑制浓度，TC50/IC50），

半数致死量（Median lethal dose, LD50）：在一定试验条件下引起50%动物死亡的剂量。

最大耐受量（0% Lethal dose, LD0）：不引起受试动物死亡的最高剂量。

附件二

手性药物质量控制研究技术指导原则

手性药物质量控制研究技术指导原则

一、概述

三维结构的物体所具有的与其镜像的平面形状完全一致，但在三维空间中不能完全重叠的性质，正如人的左右手之间的关系，称之为手性。具有手性的化合物即称为手性化合物。手性是自然界的一种基本属性，组成生物体的很多基本结构单元都具有手性，如组成蛋白质的手性氨基酸除少数例外，大都是L-氨基酸；组成多糖和核酸的天然单糖也大都是D构型。作为调节人类的相关生命活动而起到治疗作用的药物，如果在参与体内生理过程时涉及到手性分子或手性环境，则不同的立体异构体所产生的生物活性就可能不同。手性化合物除了通常所说的含手性中心的化合物外，还包括含有手性轴、手性平面、手性螺旋等因素的化合物。在本指导原则中所指的手性药物主要是指含手性中心的药物，其它类型的手性药物也可参考本指导原则的基本要求。

手性药物是指分子结构中含有手性中心（也叫不对称中心）的药物，它包括单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体的不等量的混合物以及外消旋体。不同构型的立体异构体的生物活性也可能不同，大致可分为以下几种情况【1】：

1）药物的生物活性完全或主要由其中的一个对映体产生。如S-萘普生在体外试验的镇痛作用比其R异构体强35倍。

2）两个对映体具有完全相反的生物活性。如新型苯哌啶类镇痛药-哌西那朵的右旋异构体为阿片受体的激动剂，而其左旋体则为阿片受体的拮抗剂。

3）一个对映体有严重的毒副作用。如驱虫药四咪唑的呕吐副作用是由其右旋体产生的。

4）两个对映体的生物活性不同，但合并用药有利。如降压药-萘必洛尔的右旋体为β-受体阻滞剂，而左旋体能降低外周血管的阻力，并对心脏有保护作用；抗高血压药物茚达立酮【2】的R异构体具有利尿作用，但有增加血中尿酸的副作用，而S异构体却有促进尿酸排泄的作用，可有效降低R异构体的副作用，两者合用有利。进一步的研究表明，S与R异构体的比例为1:4或1:8时治疗效果最好。

5）两个对映体具有完全相同的生物活性【3】。如普罗帕酮的两个对映体都具有相同的抗心率失常作用。

正是由于手性药物的不同立体异构体在药效、药代及毒理等方面都可能存在差异，美国FDA在其关于开发立体异构体新药的政策【4】中要求在对手性药物进行药理毒理研究时，应分别获得该药物的各立体异构体，进行必要的比较研究，以确定拟进一步开发的药物。所以手性药物药学研究的主要任务就是为药物的筛选与进一步研究提供足够数量与纯度的立体异构体。本指导原则是在一般化学药物药学指导原则的基础上，并充分考虑手性药物的特殊性而起草的，其目的是为手性药物的药学研究提供一般性的指导。本指导原则中所说的手性药物主要针对单一的立体异构体、两个以上（含两个）立体异构体组成的不等量混合物。

由于手性药物的研发是一项探索性很强的工作，情况也比较复杂，所以在使用本指导原则时，还应具体问题具体分析：在遵循药品研发的自身规律以及手性药物一般要求的基础上，根据所研制药物的特点，进行针对性的研究。如采用本指导原则以外的研究手段与方法，则该方法或手段的科学性和可行性必须经过必要的验证。

二、手性药物药学研究的基本思路

手性药物药学研究的基本思路为：除了要遵循已有的各项药学研究指导原则外，还需要针对手性药物的特点进行研究。各项研究的具体要求如下：在原料药制备工艺研究时，应根据手性中心的引入方式，采取有效的过程控制手段，严格控制手性原料与每步反应产物的光学纯度；在结构确证时，需根据化合物本身的结构特点，并结合其制备工艺、结构确证用对照品及文献数据等已有的研究基础，选择合适的方式来证明该药物的绝对构型；在选择制剂的剂型、处方与工艺时，应注意保持手性药物构型的稳定，不产生构型变化；质量研究时，应结合工艺与各手性中心的稳定性确定需研究控制的立体异构体杂质，并注意验证各种手性分析方法的立体专属性；在制订质量标准时，应综合各方面的研究数据，合理有效地监控产品的光学特性与光学纯度；在稳定性研究时，应设立灵敏、立体专属性的光学纯度检测指标，以监测构型的稳定性。

各项药学研究之间也是紧密联系、相互印证的，需要随时参考其它研究的结果，以使整个药学研究工作更为全面与准确。下面分别论述各药学研究间的关系：

（一）  结构确证研究与原料药制备工艺间的关系

对于通过化学合成制备的手性药物来说，在确证其构型时，应充分利用从制备工艺中所获取的信息，为结构确证提供必要线索，从而使结构确证研究更容易进行。当原料药中的某一个手性中心是从起始原料或试剂中引入的，并且在后续的反应过程中，该手性中心并未受到影响，或对手性中心构型的影响是明确而定量发生的，此时，如果该起始原料或试剂的立体结构是已知的，根据已知的原材料立体结构及相关的制备工艺，通过经典的化学相关法即可确证原料药中该手性中心的构型。

在鉴定立体异构体杂质的结构时，也可以结合制备工艺中各步反应的机理与可能的副反应来综合分析，确定杂质的可能结构范围后，再选择针对性强的结构确证方法加以验证，以减少杂质结构确证研究的工作量，降低其难度。

分析确定了在工艺中产生的立体异构体或其它杂质的结构后，还可以帮助我们进一步了解反应的机理，优化工艺条件，尽量减少反应副产物的生成。所以杂质的结构确证反过来又可以指导工艺的优化。

（二）  质量研究及标准制订与其它研究间的关系

1.        与制备工艺间的关系

质量研究时应结合制备工艺，分析工艺中可能产生的手性杂质，确定须在质量研究中分析检测的目标杂质，然后根据这些杂质是属于非对映异构体还是对映异构体，选取合适的分析方法，并且有针对性地对这些杂质的检测方法进行验证。

质量标准的控制必须与原材料的源头控制及生产的过程控制相结合才能切实控制上市产品的质量，尤其对于含多个手性中心的药物更是如此。因为立体异构体的数量与手性中心的数目成指数关系，在手性中心较多（一般大于或等于3）时，仅通过终产品的质量标准来控制所有的立体异构体杂质，在技术上有一定的难度，有时甚至做不到。这时一定要根据工艺中手性中心的引入方式，合并采用源头控制及生产的过程控制，来全面控制产品的光学纯度。这样既能有效地控制产品的光学纯度，又能合理地降低终产品质控的难度。

其次，通过了解制备工艺，可以帮助我们全面掌握产品的质量控制情况，分析可能产生的工艺杂质，从而在标准中进行合理的控制。对于手性药物来说，我们可以通过了解手性中心的引入方式，分析各种手性杂质产生的可能性，在采用科学合理的分析方法获取足够数据的基础上，才能明确在质量标准中需控制的各种立体异构体杂质。

2.        与稳定性研究间的关系

首先，质量研究应对稳定性研究中采用的手性分析方法进行全面的验证工作，以保证分析方法的立体专属性。其次，根据稳定性研究中手性杂质的变化情况，判断手性药物的构型在各种环境因素的影响下，以及放置过程中是否稳定，是否有构型变化现象的产生，从而确定是否需在质量标准中控制这些手性杂质。

三、原料药的制备

单一的立体异构体的制备方式主要有两种：一是在动植物体内天然生成或生物转化产生的，再通过分离提取得到；二是合成或半合成的方式，其中也包括某一步或几步反应采用生物催化方式。由于第一种方式的机制比较复杂，且除分离提取外，对其工艺的控制与通常情况下所采用的合成的方式不同，故在本节内容中主要针对第二种方式进行阐述，第一种方式也可参考本节的主要原则。

手性药物作为一类特殊的化学药物，对其制备工艺的研究首先需要遵循化学药物制备工艺研究的指导原则，然后才能考虑其特殊性。在进行制备工艺研究时，手性药物的一个特殊点在于：在研究与制备过程中需要随时关注手性中心的变化，并控制其光学纯度。基于手性药物的这一特点，在研究其制备工艺时，应遵循的一个重要原则是：对所有的手性原料与试剂均应控制其光学纯度，引入手性中心后的各反应中间体也应结合反应机理，对可能产生的立体异构体杂质进行有效的分离、控制。这样就能与终产品的质量控制相结合，达到全面控制产品光学纯度的目的。

由于手性中心的引入方式不同，在工艺中控制光学纯度的方式也各有不同，所以下面将根据手性中心的引入方式分别进行阐述：

（一）直接从起始原料或试剂中引入

在此情况下，终产品中的手性中心是从光学纯的起始原料或试剂中引入的，在后续的制备过程中，不再涉及手性中心的构型改变，或涉及到的构型改变是可控的。因此，终产品的光学纯度主要取决于以下两个方面：起始原料或试剂的光学纯度；后续反应过程是否会影响到已有的手性中心，从而产生构型变化的可能性及程度。所以在进行工艺研究时，首先要采用立体专属性的分析方法严格控制起始原料或试剂的光学纯度，制定合理可行的手性杂质的限度。其次要根据后续反应的机理，充分分析后续反应是否会影响已有手性中心的构型，如可能会产生影响时，应研究与优化工艺条件，尽量避免或减少构型变化的产生。

由于在后续反应中存在构型变化的可能性，所以，在制备工艺中仅控制起始原料或试剂的光学纯度是不充分的，尤其是当终产品中存在多个手性中心，且难以对终产品中的所有立体异构体杂质进行有效控制时，就需要结合工艺中的过程控制来综合控制终产品的光学纯度。这就要求在进行工艺研究时，对引入手性中心后的每步反应的中间体中的立体异构体杂质进行检测，分析与监测构型变化的可能性。如没有发生构型变化，则只需根据工艺优化与验证的结果，在制备工艺中严格控制工艺操作参数即可；如可能会发生部分构型变化，则除了需严格控制工艺操作参数外，还需采用可靠的指标对中间体的光学纯度进行控制，即对该步反应中间体中的立体异构体杂质进行严格的控制。

总之，在此种情况下，除了需对手性中心引入的源头——起始原料或试剂进行光学纯度控制外，还需根据终产品质控的难度分别采用上述不同的过程控制方式，以切实控制终产品的光学纯度。

（二）不对称合成

此种情况是指采用立体选择性或专属性的反应（包括酶催化反应）在分子中引入所需构型的手性中心，所以终产品的光学纯度直接取决于该步反应的立体选择性。为保证所采用方法的立体选择性，首先应尽可能查阅相关的文献资料，充分了解所用不对称合成反应的反应机理、反应条件、立体选择性等，以选取合适的反应；其次，在工艺研究中应对该步不对称反应的工艺操作参数进行筛选优化，并对产物的立体异构体进行严格的监测，确定该步反应的工艺条件与反应产物的光学纯度控制指标。引入手性中心后，进行后续反应时仍可能产生构型变化，故同样需要根据终产品质控的难度分别采用不同的过程控制方式，来综合控制终产品的光学纯度。此外，不对称合成中有可能使用一些毒性较大的催化剂，在后处理过程中应注意控制其残留。在质量研究中对这些催化剂的检测方法进行研究与验证，并在质量标准中对其残留量进行控制。

两个以上（含两个）立体异构体组成的不等量混合物的合成主要是通过不完全的立体选择性反应得到的，此时在进行制备工艺研究时，其主要任务是确定合适的工艺参数，保证能稳定地获得组成固定并符合要求的混合物。

（三）消旋体的拆分

此种方式是指采用手性拆分试剂与外消旋的中间体或终产品反应生成非对映异构体，分离纯化得到所需的非对映异构体，再去掉手性拆分试剂，从而得到所需构型的手性化合物。在此工艺中影响终产品的光学纯度的因素有：手性拆分试剂的光学纯度、分离纯化是否完全、拆分及后续反应的构型变化。针对以上影响因素，要控制终产品的光学纯度，可采取以下措施：首先应采用光学纯度尽可能高的拆分试剂；其次，应尽量纯化与拆分试剂反应所得的非对映异构体，因为这是控制成品光学纯度的重要步骤。在这两个措施中，均应采用合适的方法严格控制试剂与产品的光学纯度。

除此之外，随着手性拆分技术的进步，也可以采用制备型的手性色谱技术来直接分离对映异构体，从而得到所需的目标化合物。

总之，在手性药物制备工艺研究中，如果能充分考虑从工艺中对产品的光学纯度进行有效的全程控制，就能从源头上控制产品的质量。尤其是当终产品的质量标准难以全面有效地控制其光学纯度时，就更应该重视制备工艺研究中的过程控制。

四、结构确证

由于手性药物具有立体结构，并且在非手性条件下，对映体一般具有相同的熔点、溶解度、色谱保留行为、红外光谱（Infrared Spectroscopy，IR）、核磁共振谱（Nuclear Magnetic Resonance，NMR），因此手性药物结构确证具有一定的特殊性，在进行结构确证时，除应符合结构确证的一般原则外，还应特别注意对其构型进行研究与确证。

（一）手性药物结构确证的基本原则

手性药物结构确证的总体原则：应注意确证手性药物分子的绝对构型，对各手性中心的绝对构型是R还是S（或其它的绝对构型表示方式）均应确证清楚。对于单一的立体异构体，只需确证该分子中各手性中心的绝对构型；而对于立体异构体的混合物，则需要对各立体异构体的绝对构型及立体异构体间的比例进行确证。

构型的确证方法大体分为两类：直接法与间接法。直接法是指只需通过某一单一的方法即可确证手性药物的构型，例如，单晶X射线衍射法（Single-crystal X-ray Diffraction，SXRD）；间接法是指仅靠对待测物进行分析，尚难以确证其构型，而需综合其它数据，如与其同系物的相关分析数据相结合才能确定待测物的构型。例如，比旋度、手性色谱、核磁共振以及旋光光谱（Optical  Rotatory  Dispersion，ORD）、圆二色谱（Circular Dichroism，CD）等分析方法都属于间接法。化学相关法也属于间接法。

除下面介绍的仪器分析方法外，也可采用化学相关法确证手性药物的构型。在手性药物的制备过程中构型的变化是已知的情况下，根据起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性以及各中间体的立体结构也可间接获得最终产品（药物）的构型信息。该方法在仪器分析方法成熟以前使用较多。

在确证手性药物的结构时，可采用常规方法确证药物的结构式；然后再根据手性中心的数量、起始原料的构型、化学合成方法的立体选择性、文献数据、对照品等相关信息，有针对性地选用比旋度测定、手性高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）或气相色谱法（Gas Chromatography，GC）、化学相关法、SXRD、CD、ORD以及奥氏核效应（Nuclear Overhauser  Effect，NOE）差谱等方法对其绝对构型进行确证。因为比旋度测定相对比较简便，且与分子的构型有一定的相关性，所以一般情况下比旋度是必需的检测项目之一。

此外，在绝对构型的确证中，为保证结果的准确性，除采用一种方法外，需考虑采用另一种方法加以确认。

（二）手性药物构型确证的主要方法

下面对手性药物构型确证的主要方法分别进行简要介绍。  

1．X射线衍射法（X-ray Diffraction，XRD）

  由于单晶X射线衍射法可以独立确定分子的绝对构型，所以在其他相关信息比较缺乏的情况下，如要确证手性药物的绝对构型，建议采用单晶X射线衍射法。

  单晶X射线衍射法是通过单色X光源，常用CuKα(1.54178Å)与MoKα（0.71073Å）对具有一定几何尺寸大小（0.01-1.00 mm）的药物单晶体样品（由多个晶胞组成）进行X射线衍射实验，记录衍射数据并经相位计算即可获得药物分子立体结构的相关定量信息，如药物分子的相对或绝对构型以及药物晶体中存在的结晶水/溶剂含量与位置等一系列信息。

通常可采用四圆衍射仪（低功率光源）、CCD衍射仪（低功率光源）或IP面探测仪（高功率光源）进行手性药物分子构型的测定。

单晶X射线衍射法测定分子绝对构型包括直接与间接两种方法：

直接法：其测定原理是应用不同化学元素对X射线的反常散射（色散）效应。若待测药物样品仅含有C、H、N、O元素时，应使用CuKα辐射，衍射实验的θ角度不低于57o；若待测样品中含有原子序数大于10的元素时，可以应用MoKα辐射，衍射实验的θ角不低于25o。

间接法：利用分子结构中部分已知构型的基团确定分子构型。衍射实验采用CuKα或MoKα辐射均可。

应注意的是：由于单晶X射线衍射结构分析的对象仅为待测样品中的一颗晶体，样品缺少普遍性，需对药物样品进行粉末X射线衍射（Powder X-ray Diffraction，PXRD）实验，用单晶结构数据计算该构型手性药物的理论粉末X射线衍射图谱，并与实验粉末X射线衍射图谱比较，当二者一致时即可证明衍射用单晶具有普遍性，从而确定手性药物的构型。

2．圆二色谱

该项测试的原理主要是通过测定光学活性物质（待测物）在圆偏振光下的Cotton效应，根据Cotton效应的符号获得药物结构中发色团周围环境的立体化学信息，并与一个绝对构型已知的与待测药物结构相似化合物的Cotton效应相比较，即可能推导出待测物的绝对构型。

此外对于一些具有刚性结构的环体系的羰基药物，通过比较其Cotton效应的符号并结合经验规律“八区律”，亦可能预言某些羰基药物的绝对构型。

3．旋光光谱

手性药物（溶液）在偏振光下存在旋光现象，其旋光值随入射偏振光波长的改变而改变。在同系物中，相同的化学反应使旋光值按相同的方向改变，而不改变其旋光的方向，通过比较相关化合物（药物）的旋光性，可得到手性药物的相对构型信息。如能得知药物旋光光谱的可测范围，则在一系列反应后，药物绝对构型可从用于制备该药物的底物构型推导得到。

应注意的是，在采用该方法测定药物绝对构型时，应与绝对构型已知且与待测药物结构相同或相似化合物，在相同的实验条件下测定旋光光谱，以保证比较结果的可靠性。

4．核磁共振法

4.1 NOE差谱

通过对具有刚性结构（或优势构象）药物分子中某一质子的选择性照射，致使与该质子在空间上距离较近的相关质子峰强度的增减和相互间偶合作用的消失，从而推测出相关质子在空间的相对位置，进而可获得药物的构型信息。

4.2 通过测定手性衍生物的NMR来确定其绝对构型。

待测手性分子与已知构型的一对对映异构体反应，生成两个非对映异构体后，分别测定各自分子中氢的化学位移，通过化学位移的比较，并结合计算等方法，从而推导出该手性分子的绝对构型。

例如，Mosher法【5】是将待测手性醇（或胺）与（R）或（S）-α－甲氧基－α－三氟甲基－α－苯基乙酸（MTPA）反应生成相应的酯或酰胺，然后测定该酯或酰胺的核磁共振氢谱。由于该方法已事先研究确定了两种不同构型的手性醇（或胺）生成相应的酯或酰胺后，手性碳上的氢的化学位移的变化规律，所以根据实测的化学位移的变化情况即可确定该手性醇（或胺）的绝对构型。由此可见，这类方法也属于间接法，可用于判断创新药物的绝对构型。

五、制剂处方及工艺

手性药物制剂研究的总体目标与普通化学药物是一致的，主要研究项目和思路总体上可以参照一般化学药进行。对于手性药物而言,处方及工艺研究的重点在于保证手性药物构型不变。手性药物构型的稳定情况也是手性药物制剂剂型选择时需要考虑的重要因素，如其稳定的pH范围，固态及液态下构型稳定情况，对光、热、空气等因素的稳定情况等。如果研究显示手性药物在溶液状态下构型不够稳定，可发生构型变化，则不宜选择注射剂、口服溶液等液体剂型。

手性药物处方筛选及工艺研究的重点是通过选择适宜的辅料和工艺条件，避免引起手性药物构型的转变。研究中应通过相应的验证实验证明选择的处方及制备工艺不会引起手性药物构型的变化。研究验证工作可以在处方筛选和工艺研究过程中进行，增加对手性药物立体异构体的考察，以证明某一处方或某一工艺条件下药物构型的稳定。如考察不同pH值的系列处方，或某一处方灭菌前后药物立体异构体的变化情况等，从而确定该处方或工艺条件下，手性药物构型的稳定情况。同时，研究验证工作也可以在确定初步的处方和制备工艺后，在制剂的稳定性评价中进行，即对制剂基本项目考察合格的样品，在选择两种以上处方样品进行影响因素考察时，增加考察药物构型的稳定情况，进而筛选出相对合理的处方。

六、质量研究与质量标准

（一）质量研究

1．研究项目的确定

比旋度、立体专属性的鉴别项、立体异构体杂质检查以及立体专属性的含量测定等是反映药物立体化学特征的检测项目，在质量研究中要综合考虑药物研发的全过程确定研究项目。鉴别、光学纯度检查和含量测定等项目的取舍可统筹考虑，如果鉴别和检查项能够控制其光学特征和光学纯度时，含量测定可采用非立体专属性的测定方法。

2．分析方法及其选择

分析方法直接关系到分析结果的准确性，因此，选择合适的光学纯度分析方法是手性药物质量研究的首要问题。

一般情况下，比旋度可按照药典附录的要求进行研究，需要注意的是选定的光源等测定条件应使测得的比旋度数值适中，能较灵敏地反映药物的光学特性；必要时除使用通常的钠灯光源外，还可选用汞灯等特定光源。影响比旋度数值的因素较多，包括使用的溶剂、测试液的浓度、测定时的温度、产品的化学纯度、光学纯度及仪器数据的正常波动等，因此，该数值的变化并不一定能灵敏、准确地反映出立体异构体含量的变化。通常情况下，仅采用比旋度作为光学纯度的质控指标是不完善的，该方法需与其它立体专属性更强、灵敏度更高的分析方法相结合，才能较好地控制产品的光学纯度。天然来源的具有多个手性中心的药物如果难以进行立体异构体杂质的控制，且试验或文献数据证明其构型不易发生改变时，可仅用比旋度范围对其光学特性进行一定的控制。

理论上，非对映异构体之间可采用非立体专属性的方法进行分离检测，故以下仅针对对映异构体杂质的检测方法进行阐述。从方法的专属性及灵敏度考虑，一般多采用手性分离的方法检测对映异构体。HPLC、GC、毛细管电泳法（Capillary Electrophoresis，CE）、超临界色谱法（Supercritical Fluid Chromatography，SFC）及薄层色谱法(Thin Layer Chromatography，TLC)在这方面都有研究应用，但以前三者的应用较多。

色谱法拆分药物对映体可分为直接法和间接法两类。直接拆分法是指不经衍生化而直接分离对映体药物，可以分为手性固定相（Chiral Stationary Phase, CSP）法和手性流动相添加剂（Chiral Mobile Phase Additive, CMPA）法。前者是将手性源合成到普通固定相上，形成手性固定相。虽然手性固定相的制备有一定难度，且手性柱通用性差、供试品有时需作柱前衍生化处理等，但是该法的色谱系统稳定性好、方法重现性较好、使用方便，所以在手性药物的研究中应用较多。后者是在流动相中加入手性选择剂而在普通色谱柱上分离手性化合物，其优点是可采用普通的非手性柱、操作简便、分析过程较少发生消旋化；通过改变CMPA的种类、浓度及流动相组成等多种途径可优化分离条件，并控制出峰顺序。该方法的缺点是其色谱系统稳定性较差，平衡时间较长，CMPA消耗较多，某些CMPA欠稳定，且有时干扰检测；CMPA有时需要自行合成，不如手性固定相法方便。但因其制备难度小于CSP，在进行手性药物前期研究时，因不易获得商品化的CSP，本法仍有较高的应用价值。间接拆分法主要是指手性试剂衍生化法（Chiral Reagent Derivatization,CRD），其原理主要是利用对映体混合物在预处理或前置柱中先与高光学纯度的手性衍生化试剂反应，生成一对非对映体，然后利用他们在理化性质上的差异，在非手性柱（也可用手性柱）上加以分离。此法涉及供试品的化学转化和分离等预处理过程，有时可引起某一对映体组分的消旋化、损失或富集，且手性衍生化试剂的光学纯度及衍生化反应的速率或收率等都会影响分析结果的准确性，研究中应加以关注。

3．分析方法的验证

方法的验证应参照分析方法验证的技术指导原则，对于光学纯度检查方法的验证，立体专属性是考察的重点。立体专属性系指在其它手性杂质可能共存的情况下，采用的方法能正确测定出被测物的特性。

方法专属性的验证，可采用消旋体或与对映异构体混和进样的方式考察对映体间的分离度。同时需要考虑产品中其它有关物质对异构体检测的影响，可采用各步反应的中间体（尤其是后几步反应的中间体）、粗品来进行系统适用性研究，考察各杂质与各立体异构体峰相互间的分离度是否符合要求。另外，还可用酸、碱、光、热、氧化等适度破坏试验来验证该方法能否避免降解物对对映体检测的干扰。一般情况下，其它有关物质的检查已有专门项目进行控制，如有必要，可通过选择检测波长等方法避免其它有关物质对异构体检测的干扰。

4．定量方式

定量方式一般有峰面积归一化法、主成分自身对照法、异构体杂质对照品法。

因为两对映体的紫外吸收特性相同，如果主成分与其异构体含量或定量限在同一线性范围，采用峰面积归一化法定量更为简便、快捷；否则，可采用主成分自身对照法。当使用异构体杂质对照品法时，应注意对该对照品的制备工艺和构型进行详细研究，并制订其质量要求。

（二）质量标准

1. 手性药物光学纯度控制的原则

手性药物质量标准的构成与化学药物基本相同，特点是质控项目要体现其光学特征的质量控制。在手性药物质量标准的制订过程中，需要紧密结合制备工艺，确定针对性的质控项目，以有效控制产品的质量。制订质量标准时要根据对映异构体杂质的生物活性（毒性）、原料药的制备工艺（生产中的过程控制、生产的可行性及批与批之间的正常波动）、制剂工艺（制剂过程中是否发生构型转化）、稳定性考察（贮藏过程中是否发生构型转化）等的研究结果及批次检测结果来确定质量标准中需控制的立体异构体及其限度。需控制的立体异构体杂质应根据上述研究的结果加以确定，限度的确定则应首先考虑杂质的安全性。一般情况下，生物活性较强的对映体杂质，需根据研究结果严格控制其限度。在上市消旋体药物基础上研发的单一对映体药物，经临床验证其对映体杂质的毒副作用相对较小时，限度可适当放宽。非对映体杂质如能采用普通色谱方法进行检测，可按一般有关物质加以控制；毒副作用较大时，需单独控制其限度。

2．质量标准的制订

2.1原料药

【性状】项下的比旋度是手性药物的特征之一，可以说明药品的光学特征（旋光方向）和大致纯度。一般不宜单独用以控制产品的光学纯度，需要与检查项下的异构体检查项相互补充，以较好地控制产品质量。对于含多个手性中心的药物，如难以在质量标准中对所有可能产生的立体异构体杂质进行直接控制时，可用比旋度范围作为其光学特征和纯度的粗略控制方法。此时，由于该方法的局限性，需与严格的生产过程的质量控制相结合，并在充分考察产品质量的基础上，制订比旋度的范围。

【鉴别】项目的设立需要根据质量标准的整体情况综合加以考虑。已制订比旋度检查或立体异构体检查项时，可不考虑鉴别方法的立体专属性；否则，需要制订反映药物光学特征的鉴别方法。

【检查】项下立体异构体的检查是手性药物重要的质控项目之一。对于单一对映体药物或两对映体以一定比例组合给药的药物，须制订立体异构体检查项，以控制立体异构体杂质或两对映体的比例组成；含两个手性中心以下的单一对映体药物，一般需要对生产与贮藏过程中可能产生的各立体异构体杂质分别制订限度要求；含多个（2个以上）手性中心的单一对映体药物，由于建立分析方法难度较大，可在获得充分的安全性信息基础上，结合制备工艺的具体情况、过程控制措施与稳定性考察的结果，仅对生产与贮藏过程中产生的及毒性（生物活性）较大的立体异构体杂质作单独控制。

目前情况下，手性色谱法是手性药物立体异构体检查常用而有效的方法，但该方法不能直接反映药物的光学特征，需要与性状项下的比旋度测定相互补充，以有效控制药品质量。

天然来源的手性药物经试验或充足的文献证明其构型不发生改变时，如氨基酸、糖类等，可以不制订立体异构体杂质检查项；而在性状项下，采用比旋度范围作为其光学特征的控制项目。

【含量测定】在鉴别和检查项能够反映手性药物光学特征和光学纯度时，可采用非立体专属性的测定方法。

2.2制剂

制剂质量标准光学特征和光学纯度控制项目的制订，需要考虑制剂过程、贮运过程对手性药物构型的影响。如果上述过程对药物构型有影响，则制剂质量标准中需要制订立体异构体的检查项目；反之，可不对原料药中引入的立体异构体杂质进行控制，但需要考虑制订反映药物光学特征的鉴别方法，尤其在该药物的消旋体或另一对映体已上市的情况下，鉴别方法的立体专属性更为重要。

七、稳定性研究

根据研究目的不同，稳定性研究内容可分为影响因素试验、加速试验与长期留样试验等。手性药物稳定性研究基本原则和方法总体上与普通化学药物一致，但手性药物稳定性试验还需重点考察药物构型的稳定性，即通过设立适宜的光学纯度检查项目和采用灵敏、立体专属性的检查方法（如立体异构体检查等），考察原料药或制剂中手性药物的光学纯度或立体异构体比例变化情况。

一般来说，监控手性药物光学纯度的检测指标有比旋度及立体异构体限度检查。通常情况下，仅采用比旋度作为检测指标是不完善的，很难准确地反映构型的变化情况。所以建议采用立体异构体限度检查这一比较灵敏的指标进行稳定性监控，并注意其实测数值的变化情况。另外，由于立体异构体包括对映异构体与非对映异构体，在选择监控对象时要考虑产品的结构特点，有时仅监测对映异构体可能并不全面。对于含一个以上手性中心的化合物，只有当所有的手性中心的构型均发生转变时，才会得到该手性药物的对映异构体，而这种可能性相对较小。实际上更可能发生的情况往往是分子中仅有一个或两个手性中心的构型发生了改变，从而产生非对映异构体杂质。所以在这种情况下，应根据前期的相关试验数据、理论分析或文献调研的结果，针对性地监测相应的立体异构体的含量，以更准确地反映该手性药物构型的稳定性。

影响因素试验一般需进行热、湿、光照考察，也可以根据药品的性质设计其他试验，如考察pH值、氧化等因素对药品构型的影响；对于需要溶解或者稀释后使用的药品，如注射用无菌粉末，应考察临床使用条件下的稳定性。上述研究中均需注意考察药物构型的变化情况。

通过对手性药物加速试验和长期留样试验中药物构型稳定性的考察，可以反映药品在加速和正常贮藏条件下构型的稳定情况。

在制剂的稳定性研究中也要注意监控活性成分构型的变化。即使已证明原料药的构型在一般情况下是稳定的，也不能保证其与制剂中各辅料共存时，在特定的制剂工艺条件（酸、碱、溶液状态、高温等）下，构型仍然稳定。所以，仍有必要在制剂中监测其构型的稳定性。

八、 名词解释

绝对构型(Absolute Configuration)：手性分子中，不对称中心上各个取代基在空间的排列。本文中简称构型。

相对构型（Relative Configuration）：手性分子中，不对称中心的构型是通过与已知构型的手性中心或物质相比较而得到的。

R构型(R Configuration)：手性分子中，连接到不对称中心碳原子上的不同原子或基团a，b，c，d，以a>b>c>d顺序排列。如果从中心碳原子到最小的基团d方向，观察到a→b→c是顺时针方向，则这个碳中心的构型被定义为R。

S构型(S Configuration)：手性分子中，当连接到不对称中心碳原子上的a，b，c，d是不同基团时，以a>b>c>d顺序排列。如果从中心碳原子到最小的基团d方向，观察到a→b→c是逆时针方向，则这个碳中心的构型被定义为S。

注：其它元素如P、S、N等或其它手征性形式的绝对构型的表示方法请参考相关专业书籍。

对映异构体(Enantiomers)：其分子为互相不可重合的镜象的立体异构体。

非对映异构体(Diastereoisomers)：对于分子中具有二个或多个不对称中心，并且其分子互相不为镜象的立体异构体，常简称为“非对映体”。

外消旋体(Racemate)：由等量的两个对映体组成的混合物。由于其作用相互抵消，因此表现为不能使偏振光旋转，因而无光学活性。

左旋体（Levorotatory）：当偏振光通过旋光性物质时，能使偏振光振动平面按逆时针旋转的立体异构体；以（-）表示。

右旋体（Dextrarotatory）：当偏振光通过旋光性物质时，能使偏振光振动平面按顺时针旋转的立体异构体，以（+）表示。

光学纯度(Optical purity)：根据实验测定的旋光度，在两个立体异构体混合物中，一个异构体所占的百分数。现在常用对映体或非对映体纯度来代替。

九、 参考文献

1．     黄晓龙.浅谈在立体异构体新药的研究中需注意的问题. 中国新药杂志，2001，10(1)：65～67。

2．     杜玉民，刘伟娜，白希瑞.手性药物。临床荟萃，2003，18（20），1196－1197。

3．     尤启冬，林国强.手性药物——研究与应用。化学工业出版社，2004，北京。

4．     黄晓龙. 美国FDA关于开发立体异构体新药的政策简介. 中国新药杂志，2000，9（9）650～652。

5．     林国强，陈耀全，陈新滋，等.手性合成——不对称反应及其应用（第二版）。科学出版社，2005，北京。

附件三

药物生殖毒性研究技术指导原则

药物生殖毒性研究技术指导原则

一、概述

生殖毒性研究（Reproductive toxicity study）是药物非临床安全性评价的重要内容，它与急性毒性、长期毒性、遗传毒性等毒理学研究有着密切的联系，是药物进入临床研究及上市的重要环节。拟用于人体的药物，应根据受试物拟用适应症和作用特点等因素考虑进行生殖毒性试验。

在药物开发的过程中，生殖毒性研究的目的是通过动物试验反映受试物对哺乳动物生殖功能和发育过程的影响，预测其可能产生的对生殖细胞、受孕、妊娠、分娩、哺乳等亲代生殖机能的不良影响，以及对子代胚胎-胎儿发育、出生后发育的不良影响。生殖毒性研究在限定临床研究受试者范围、降低临床研究受试者和药品上市后使用人群的用药风险方面发挥重要作用。

本指导原则适用于中药、天然药物和化学药物的生殖毒性研究。

本指导原则重点阐述动物生殖毒性试验中动物、给药剂量、给药方法、试验方案选择的基本原则，并介绍一些常用的试验方案；对所获得数据进行分析及评价要求；以及所涉及的科学原理与背景。

二、基本原则（一）实验管理

药物的生殖毒性试验属于非临床安全性评价研究，根据《中华人民共和国药品管理法》的规定，必须执行《药物非临床研究质量管理规范》。

（二）具体问题具体分析

生殖毒性试验的设计，应在对受试物认知的基础上，遵循“具体问题具体分析”的原则。应根据受试物的结构特点、理化性质、已有的药理毒理研究信息、适应症和适用人群特点、临床用药方案等选择合理的试验方法，设计适宜的试验方案，并综合上述信息对试验结果进行全面分析评价。

（三）随机、对照、重复

生殖毒性试验应符合一般动物试验的基本原则，即随机、对照和重复。

三、基本内容（一）总体考虑1、受试物

    1.1 中药及天然药物

生殖毒性试验的受试物应能充分代表临床研究受试物或上市药品，因此受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究质量标准规定的样品，一般用中试样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等。如不采用中试样品，应有充分的理由。如果由于给药容量或给药方法限制，可采用原料药进行试验。试验中所用溶媒和/或辅料应标明批号、规格及生产厂家。

     1.2 化学药物

生殖毒性试验的受试物应采用制备工艺稳定、符合临床研究用质量标准规定的样品，并注明受试物的名称、来源、批号、含量（或规格）、保存条件及配制方法等，并附有研制单位的自检报告。所用辅料、溶媒等应标明批号、规格和生产厂家，并符合试验要求。

2、受试物药代动力学研究

在开始生殖毒性试验前，掌握一些受试物药代动力学方面的信息，对于是否应进行动物种属选择、试验设计与给药方案的调整等有重要提示作用。这些药代动力学信息可能来源于非妊娠或非哺乳期动物。在进行结果评价时，可能有必要进一步研究妊娠或哺乳期动物的药代动力学情况。（注释1）

3、试验系统3.1 实验动物

应采用哺乳动物进行生殖毒性试验。在选择动物种属和品系时，应考虑动物的背景资料、实用性、与人的相关性等。应从受试物、采用的试验方案和阐明试验结果的角度考虑所选择动物种属和品系的优缺点（注释2）。

通常应采用与其他毒理学试验相同的动物种属和品系，这样与其他毒理学试验结果具有可比性，并可能避免进行过多的预试验。大鼠实用性好、与其他试验结果的可比性高并已积累了大量的背景资料，因此可作为生殖毒性试验首选的啮齿类动物。

在胚胎-胎仔发育毒性研究中，一般还需要采用第二种哺乳动物，其中家兔已积累了丰富的背景资料，且容易获得和实用，因此家兔为优先选用的非啮齿类动物。家兔不适合时，可根据具体情况，选择另一种可替代的非啮齿类动物或第二种啮齿类动物。

通常选用年轻、性成熟的成年动物，雌性动物未经产。个体动物初始体重不应超出平均体重±20%。

动物应符合国家有关规定的等级要求，来源、品系、遗传背景清楚，并具有实验动物质量合格证。

3.2 其他试验系统

其他试验系统指哺乳动物或非哺乳动物的细胞、组织、器官，体外或体内培养体。这些系统的试验结果有助于作用机理的分析，但它们缺乏发育过程的复杂性以及母体与生长机体（胚胎）间动态的相互变化。这些系统不能明确排除某一作用，也不能对其危险性/暴露情况进行推测。这些试验系统尚不能替代目前生殖毒性试验常用的整体动物（注释3）。

4、给药4.1 剂量选择

4.1.1 中药及天然药物

可根据已有的研究资料（药理、急性毒性和长期毒性、药代动力学研究）或预试验以及受试物的理化性质和给药途径来进行剂量设计。为观察量效关系，至少应设三个剂量组，必要时可增加剂量组。高剂量应出现一些轻微的母体毒性反应，或为最大给药量/最大耐受量。低剂量应为生殖毒性方面的“未观察到不良反应的剂量水平（NOAEL）”。

4.1.2 化学药物

可根据已有的研究资料（药理、急性毒性和长期毒性、药代动力学研究）或预试验以及受试物的理化性质和给药途径来选择高剂量，高剂量范围内应该出现一些轻微的母体毒性反应，在大多数情况下，1g/kg/天为最大给药限量。低剂量应为生殖毒性方面的NOAEL。高剂量与低剂量间根据具体情况可设计1～2个剂量，以观察可能的剂量反应关系。（注释4）

4.2 给药途径

一般情况下，给药途径应与临床拟用途径一致。如果拟用途径有多种，若研究提示不同给药途径的药代动力学特点（包括分布）类似，建议采用暴露量较高的给药途径。此外，腹腔注射时可能会对子宫或胎仔产生直接作用，故采用妊娠动物进行试验时，一般不用该途径。（注释5）

4.3 给药频率

通常每天给药1次。但应参考药代动力学参数、预期临床给药情况增加或减少给药次数。

4.4对照组

应设赋形剂对照组，其给药途径、频率应与受试物组相同。当赋形剂可能产生作用或影响受试物的作用时，应另设空白对照组。

此外，根据具体情况考虑是否设阳性对照组，如新的动物系统、较长时间未进行过试验、新的试验设施等。

（二）试验方案1、试验方案选择的一般考虑

在选择试验方案时，应借鉴受试物已有的或同类药物的药理、毒理和药代动力学资料，特别是在生殖毒性方面的信息。建议优先考虑采用较为成熟的试验设计方案。对大多数药物而言，三段试验方案（常用的试验方案）通常比较合适，能够识别有可能发生损害的生殖发育阶段。但根据具体药物情况的不同，也可选择其他能充分反映受试物生殖毒性的试验方案（注释6），如单一试验设计或两段试验设计等。无论采用哪种试验方案，各段试验之间（给药处理）不应留有间隔，并可对生殖过程的各阶段进行直接或间接评价。应说明所选择试验方案的合理性。

当观察到某一作用时，应根据具体情况进行进一步的后续试验，以明确其毒性的性质、范围和原因等，包括判断其剂量-反应关系，以有助于风险评估，并有助于区分给药所致影响与偶发情况（注释7）。

联合进行多项生殖毒性试验时，应注意在动物成年期和从受孕到幼仔性成熟的发育各阶段给药。为发现给药所致的速发和迟发效应，试验观察应持续一个完整的生命周期，即从某一代受孕到其下一代受孕间的时间周期。为方便试验，可将一个完整生命周期过程分成以下几个阶段（注释8）：

A. 从交配前到受孕（成年雄性和雌性生殖功能、配子的发育和成熟、交配行为、受精）。

B. 从受孕到着床（成年雌性生殖功能、着床前发育、着床）。

C. 从着床到硬腭闭合（成年雌性生殖功能、胚胎发育、主要器官形成）。

D. 从硬腭闭合到妊娠终止（成年雌性生殖功能、胎仔发育和生长、器官发育和生长）。

E. 从出生到离乳（成年雌性生殖功能、幼仔对宫外生活的适应性、离乳前发育和生长）。

F. 从离乳到性成熟（离乳后发育和生长、独立生活的适应能力、达到性成熟的情况）。

2、常用的试验方案

常用的试验方案相当于对下述各阶段影响的联合研究：生育力和早期胚胎发育、胚胎-胎仔发育、围产期发育（包括母体功能）。

2.1生育力与早期胚胎发育毒性试验（I段）2.1.1试验目的

包括上述生命周期的A阶段和B阶段，对雌雄动物由交配前到交配期直至胚胎着床给药，以评价受试物对动物生殖的毒性或干扰作用。评价内容包括配子成熟度、交配行为、生育力、胚胎着床前阶段和着床等。对于雌性动物，应对动情周期、受精卵输卵管转运（tubal transport）、着床及胚胎着床前发育的影响进行检查。对于雄性动物，应观察生殖器官组织学检查方法可能检测不出的功能性影响(如性欲、附睾精子成熟度等)。

2.1.2动物选择

至少采用一种动物，推荐用大鼠。动物数应满足数据分析的需要，通常大鼠不少于20只/性别/组（注释9）。

2.1.3 给药期

一般情况下，交配前给药期可定为雄性动物4～10周，雌性动物2周；雄性动物给药期应持续整个交配期直至被处死，雌性动物至少应持续至胚胎着床（妊娠第6～7天）。应对交配前给药期长短的选择进行说明并提供依据（注释10）。

2.1.4 动物处理

建议雌雄动物按1:1交配。一般情况下，雌性动物在妊娠第13～15天处死，雄性动物在交配成功后处死（注释11）。

2.1.5 观察指标

试验期间：

-       体征和死亡情况，至少1次/天

-       体重和体重变化，至少2次/周(注释12)

-       摄食量，至少1次/周(交配期除外)

-       交配期间至少每日进行阴道涂片检查，以检查是否对交配或交配前时间有影响

-       其他毒性研究中已证明有意义的指标

终末检查：

-       剖检所有亲代动物

-       保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物的相应器官以便比较

-       保存所有动物的睾丸、附睾或卵巢、子宫，必要时进行组织学检查，根据具体情况进行评价

-         建议计数附睾中的精子数并进行精子活力检查

-         计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算着床数(注释12)

2.2胚胎-胎仔发育毒性试验（II段）2.2.1试验目的

包括上述生命周期的C阶段至D阶段，妊娠动物自胚胎着床至硬腭闭合给药，评价药物对妊娠动物、胚胎及胎仔发育的影响。

评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、胚胎胎仔死亡、生长改变和结构变化等。

2.2.2动物选择

试验通常采用两种动物：一种为啮齿类动物，推荐用大鼠；另一种为非啮齿类动物，推荐用家兔。应说明动物选择的合理性。（注释13）

妊娠动物数应满足数据分析的需要，通常大鼠不少于20只/组，家兔不少于12只/组（注释9）。

2.2.3 给药期

由胚胎着床到硬腭闭合(即到C阶段末)给药。通常，大鼠为妊娠第6～15天给药，家兔为妊娠第6～18天给药。

2.2.4 动物处理

在大约分娩前处死并检查雌性动物，正常情况下，大鼠约为妊娠第20/21天，家兔约为妊娠第28/29天。检查所有胎仔的存活和畸形情况。

当所用技术方法要求分别检查软组织和骨骼改变时，最好是每窝分配50%的胎仔进行骨骼检查。不管使用何种方法，至少应对50%的大鼠胎仔进行内脏检查。对于家兔，检测软组织改变，采用新鲜显微解剖技术较适合，此时，100%的家兔胎仔需进行软组织和骨骼检查。

在评价胎仔的内脏和骨骼异常情况时，若高剂量组与对照组无显著性差异，一般不需要对中、低剂量组动物进行检查。但建议保存固定的标本以备检查。

2.2.5 观察指标

试验期间：

-       体征和死亡情况，至少1次/天

-       体重和体重变化，至少2次/周(注释12)

-       摄食量，至少1次/周

-       其他毒性研究中已证明有意义的指标

终末检查：

-       剖检所有成年动物

-       保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物相应器官以便比较

-       计数黄体数，活胎、死胎、吸收胎并计算着床数(注释12)

-       胎仔体重，胎仔顶臀长

-       胎仔异常（包括外观、内脏、骨骼）

-       胎盘肉眼观察

2.3 围产期毒性试验（III段） 2.3.1试验目的

包括上述生命周期中的C阶段至F阶段，检测从胚胎着床到幼仔离乳给药对妊娠/哺乳的雌性动物以及胚胎和子代发育的不良影响；由于对此段所造成的影响可能延迟，试验应持续观察至子代性成熟阶段。

评价内容包括妊娠动物较非妊娠雌性动物增强的毒性、出生前和出生后子代死亡情况、生长发育的改变以及子代的功能缺陷，包括F1代的行为、性成熟和生殖功能。

2.3.2动物选择

至少采用一种动物，推荐用大鼠。妊娠动物数应满足数据分析的需要，通常大鼠不少于20只/组（注释9）。

2.3.3 给药期

雌性动物给药期应从胚胎硬腭闭合至哺乳结束(即上述生命周期中的C阶段至E阶段)，通常，大鼠为妊娠第15天至离乳（出生后第21天）。

该段试验并不完全包括由离乳期至青春期阶段给药，也不研究育龄期缩短的可能性。为了检测可能用于婴幼儿和儿童期药物的不良影响，应考虑具体情况，选择特定年龄段子代直接给药，进行相关试验研究。

2.3.4 动物处理

雌性动物分娩并饲养其子代至离乳，每窝选择雌、雄子代各1只，饲养至成年，然后进行交配检测其生殖能力。

2.3.5 观察指标

试验期间(母体动物)：

-       体征和死亡情况，至少1次/天

-       体重及体重变化，分娩前至少2次/周（注释12）

-       摄食量，分娩前至少1次/周

-       其他毒理研究中已证明有意义的指标

-       妊娠期

-       分娩

终末检查（用于母体，可行时也用于子代)：

-       剖检所有成年动物

-       保存肉眼观察出现异常的器官，必要时进行组织学检查，同时保留足够的对照组动物相应器官以便比较

-       着床(注释12)

-       畸形

-       出生时存活的子代

-       出生时死亡的子代

-       子代出生时体重

-       离乳前后的存活率和生长/体重，性成熟程度和生育力，应说明是否进行了窝仔动物剔除

-       体格发育(注释14)

-       感觉功能和反射(注释14)

-       行为(注释14)

3、其他试验方案

可根据受试物、拟用适应症及临床用药等特点，综合考虑其他试验方案，以全面、合理地反映受试物的生殖毒性特点（注释6）。以下为可采用的其他试验方案的两个例子。此外，能全面、合理地反映受试物生殖毒性特点的试验方案也是可以接受的。

3.1   单一（全程）试验设计（啮齿类动物）

如果将生育力和围产期试验连贯在一起全程给药，则可对生殖过程从A到F各阶段的情况进行评价。假如该试验中包括了对胎仔的检查，且在足够高的给药剂量下得出了明确的阴性结果，可不再进行进一步的啮齿类动物生殖毒性试验。

胎仔结构异常检查也可在附加的一项（或多项）胚胎-胎仔发育试验中进行，而成为两段试验。

此外，还应进行第二种动物胚胎-胎仔发育影响试验。推荐采用家兔。

3.2 两段试验设计（啮齿类动物）

如果其中包括对胎仔的检查，最简单的两段试验设计为生育力试验和围产期试验。目前研究认为，如果受试物在动物中的暴露量达到人体暴露量以上的足够范围时，围产期试验中并未发现其对产前发育有影响，那么在大多数情况下，再进行胎仔检查也不能显著改变其危险性评价的结果。

生育力试验中雌性动物给药期可持续至胚胎硬腭闭合，并参照胚胎-胎仔发育试验中的方法对胎仔进行检查。这种与围产期试验联合考虑的两段试验设计，可进行“常用的试验方案”中要求的所有检查。

此外，还应进行第二种动物胚胎-胎仔发育影响试验。推荐采用家兔。

（三）毒代动力学

本指导原则中的毒代动力学，系指结合生殖毒性试验进行的考察药物系统暴露的代谢动力学研究。毒代动力学可以描述实验动物的系统暴露与暴露剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系。本指导原则中毒代动力学研究的主要目的在于分析生殖毒性试验的结果，并利于不同的毒理学试验结果间进行科学合理的比较，为临床用药的风险评估提供参考。

毒代动力学试验应选择合适的时间点采样测定，从而获得药时曲线下面积（AUC）、峰浓度（Cmax）、达峰时间（Tmax）等参数。某些药物应结合药物血浆蛋白结合率来评价系统暴露量。毒代动力学数据可以来自生殖毒性试验的全部动物，也可以来自部分动物。毒代动力学数据应包括胎仔/幼仔数据，以评价药物和/或代谢产物能否通过胎盘屏障、能否通过乳汁分泌。此部分动物可以包括低、中、高剂量组的动物，以便估算高剂量药物在动物体内的动力学过程是否属非线性动力学过程。

建议创新性药物进行毒代动力学研究。

四、结果分析与评价

动物生殖毒性试验的最终目的在于预测人体可能出现的生殖、发育相关的毒性反应。试验结果的分析和评价是试验的必要组成部分，应对研究结果进行科学和全面的分析和评价。

（一）统计分析

选用合适的统计方法，对数据进行分析。应说明所选用统计学方法的合理性。

“显著性”检验可帮助分析试验结果。结果解释本身必须以生物学的合理性为依据。仅仅因为没有“统计学意义”而认为与对照组结果的差别并非生物学因素所致的推论可能是错误的。从某种程度上讲，认为有“统计学意义”的差别一定与生物性因素有关也可能是错误的。特别是对那些呈偏态分布的低发生率的异常表现（例如，胚胎死亡、畸胎），相关各变量的可信区间可提示可能的作用大小。应用统计学程序时，应考虑组间比较所采用的指标单位：通常用窝而不是胎仔个体为单位，若亲代两种性别动物均给药，则用交配对（也即两代试验研究中亲代的配对）为单位。

（二）数据报告

建议将试验数据制成表格，以说明每只动物的试验结果。试验组总体数据的表达形式从生物学角度看是合理的（即避免不真实的精确度），并反映变量的分布情况。各试验数据（如体重、摄食量、每窝的相应数据）制成的附录或表格应尽可能简明，用绝对值而不是计算值来表示各数据；应避免不必要的重复。

对低发生率的观察结果（如体征、尸解发现、畸形等）制表时，建议将阳性的几个试验数据一同列表。尤其是针对结构改变（胎仔畸形）的数据，应该在表格中清楚地标明出现异常胎仔的窝号和各窝受影响的胎仔（号），并写明受影响各胎仔被观察到的全部改变。如果必要，可根据异常改变的类型从原始表中总结出其他派生的表格。

（三）结果分析

通常情况下，应对受试物在动物中表现出来的生殖和发育两方面的毒性进行分析评价。如果出现阳性的生殖毒性或发育毒性结果，应评估人体中出现生殖毒性和发育毒性风险的可能性，这些阳性的毒性结果可能是在生殖毒性或一般毒性试验中出现的，也可能是在人体研究中出现的。以下为常规需要分析评价的毒性：

1、生殖毒性

生殖毒性为可能影响F0代生殖能力的结构和功能性改变，包括对生育力、分娩和哺乳的毒性影响等。

生育力  与给药相关的雄性生殖毒性可表现为生殖器官的退变或坏死、精子计数减少、精子活力或形态学改变、交配行为异常、不能交配、内分泌功能改变或总体生育力降低。与给药相关的雌性生殖毒性可表现为生殖器官损伤、配子成熟和释放相关的内分泌调节改变、交配行为异常、不能交配或总体生育力降低。

分娩  对动物产程和分娩的影响可表现为分娩起始和持续时间的改变。分娩持续时间通常报告为平均每胎耗时，或总分娩时间。

哺乳  哺乳期给药后，可能对幼仔产生暴露，也可能改变母鼠的哺乳过程（乳汁质量和数量）或改变母鼠的哺乳行为。

2、发育毒性

发育毒性为对F1代的毒性影响，包括死亡、畸形（结构异常）、生长异常和功能性毒性等。

死亡  由于发育毒性导致的死亡可能发生于自妊娠早期到离乳后的任何时间（“胚胎-胎仔死亡”仅是发育毒性所致死亡的一种）中。阳性结果可能表现为着床前或着床后丢失、早期或晚期吸收、流产、死产、新生仔死亡或离乳后死亡。

畸形  即通常所指的结构异常，表现为子代骨骼或软组织畸形或变异。

生长异常  通常表现为生长迟滞，有时生长过快或早熟也被认为是生长异常。评估生长速率的最常用指标为体重，同时也可测定顶臀长、肛门与生殖器间距离等。

功能性毒性   包括任何正常生理或生化功能的持续改变，但通常仅测定神经行为和生殖功能。常规测定指标包括自主活动、学习记忆、反射、性成熟时间、交配行为和生育力。

3、其他

很多情况下，亲代和子代所表现出来的生殖毒性可能是母体毒性所继发的。应结合相关毒性研究结果，如长期毒性研究等，判断表现出来的生殖毒性是否为母体毒性的继发结果。

（四）综合评价

生殖毒性研究是药物安全性评价与药物整体开发进程的一个有机组成部分。生殖毒性研究不能与药效学、药代动力学和其他毒理学研究割裂，试验结果应力求与其他药理毒理试验结果互为印证、说明和补充。

在对生殖毒性试验结果进行评价时，应结合以下信息进行综合分析：（1）受试物的药学特点；（2）药效学、药代动力学和其他毒理学研究的结果，特别是长期毒性试验和遗传毒性试验结果；（3）临床研究受试者人群特征以及已取得的临床研究的结果。中药、天然药物还应结合处方组成特点、方中药味毒性情况、临床应用背景情况等进行综合分析。

试验结果的评价最终应落实到临床研究受试者范围限定、风险效益评估以及必要防治措施的制定和应用上。

五、生殖毒性研究的阶段性

1、化学药物

根据受试物、拟用适应症特点，特别是临床研究受试人群的特点，可分阶段提供生殖毒性研究资料支持不同阶段的临床研究。通常情况下，应在临床研究开始前提供完整的生育力与早期胚胎发育毒性试验、胚胎-胎仔发育毒性试验资料，围产期毒性试验资料可在上市申请时提供。

但是，在一些特殊情况下，可能会需要提前提供相关生殖毒性研究资料，例如用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍、促精子生成药以及致突变试验阳性或有细胞毒作用等的新药）；而在另外一些情况下可能会适当延迟提交相关生殖毒性研究资料的时间，例如用于晚期恶性肿瘤或艾滋病的药物等。上述特殊情况下需要进行的生殖毒性试验内容也需要根据具体情况来确定。（注释15）

2、中药及天然药物

新的有效成分及其制剂、新的中药材及其制剂，可参考化学药物要求分阶段提供生殖毒性研究资料支持不同阶段的临床研究。

对于其他需进行生殖毒性研究的中药、天然药物，如用于育龄人群并可能对生殖系统产生影响的新药（如避孕药、性激素、治疗性功能障碍、促精子生成药、保胎药以及致突变试验阳性或有细胞毒作用等的药物），应根据具体情况提供相应的生殖毒性研究资料，这时需根据具体情况来确定生殖毒性试验内容及进行的时间。

在一些情况下可能会适当延迟提交相关生殖毒性研究资料的时间，例如用于晚期恶性肿瘤或艾滋病的治疗药物等。

六、参考文献

1、生殖毒性试验。见：新药（西药）临床前研究指导原则汇编（药学、药理学、毒理学）。中华人民共和国卫生部药政局，1993:216-217

2、生殖毒性和发育毒性。见：周宗灿主编，毒理学基础，第二版。北京医科大学出版社。北京，2000: 128-143

3、ICH Steering Committee. Harmonised Tripartite Guideline S5A: Detection of toxicity to reproduction for medicinal products.

4、ICH Steering Committee. Harmonised Tripartite Guideline S5B: Maintenance of the ICH guideline on toxicity to male fertility.

5、ICH Steering Committee. Harmonised Tripartite Guideline M3: Non-clinical safety studies for the conduct of human clinical trials for pharmaceuticals.

6、生殖发生毒性试验。见：日本临床前研究指导原则解说。药事日报社，2002：49-62

7、Omori Y. Principles and guidelines a review of recommendations ( on detection of toxicity ) in the three regions. In: P.F. D’Arcy and D.W.G. Harron edited, Proceedings of the First International Conference on Harmonization. Brussels 1991: 256-266

8、EEC guidelines: Detection of toxicity to reproduction for medicinal products including toxicity to male fertility.

9、FDA. Reviewer guidance: Integration of study results to assess concerns about human reproductive and developmental toxicities.

七、著者

  《药物生殖毒性研究技术指导原则》课题研究组。

八、相关注释注释1：妊娠动物的药代动力学

    由于妊娠和哺乳期动物存在生理方面的迅速变化，其药代动力学可能出现改变，最好采用分段（分二段或三段）的研究方法 。在制定试验研究计划的过程中，药代动力学资料（常来源于非妊娠动物），可为判断动物种属的总体适用性提供信息，也可有助于研究方案的确立和剂量的设定。在试验过程中，药代动力学研究可以为设定给药剂量提供参考，也可提示其与预期结果是否存在明显偏差。

注释2：动物选择

应注意选用与人类相关的动物。如果已有的药代动力学、药理毒理研究信息能显示某种属与人类相关，则可仅采用此一种动物进行试验。如果某一种属动物未表现出（与第一种动物相同的）与人类的相似性，则将其选作第二种动物的价值很小。

所有的动物种属都有其优点，例如，大鼠，其次是小鼠，都可用作进行生殖毒性研究通用的较佳动物种属。家兔作为非啮齿类动物用于胚胎毒性研究，也可用于生育力研究。家兔和犬的精液样品可不借助于痛苦性的技术（如电刺激采精）而获得，可用于精液分析研究。

其他大多数动物种属通常不适合用于生殖毒性研究，这些动物可能仅仅适合用于进行某些特定的试验研究。

所有动物种属都有其不足之处，例如：

大鼠：对性激素敏感；不适合用于多巴胺受体激动剂的研究，因其早期妊娠的发生和维持所依赖的激素主要是催乳素；妊娠后期对非甾体抗炎药高度敏感。

小鼠：代谢率高，易惊、群体畸形现象（所有种属动物均会出现）特别明显，胎仔小。

家兔：常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，临床表现的解释较困难。

豚鼠：常缺乏药代动力学和毒理资料，对一些抗生素和消化道功能紊乱敏感，胎仔发育期长，历史背景资料不足。

家猪和/或小型猪：群体畸形的背景情况多变,所需的受试物量大，需要较大饲养空间，历史背景资料不足。

白鼬：如果不采用特殊的管理系统，只能季节性繁殖（其成功与否主要取决于人和动物的相互影响），历史背景资料不足。

仓鼠：静脉给药虽非不可能，但相当困难，会将受试物存于颊部小囊中而影响实际给药量，攻击性非常强，对肠道功能紊乱敏感，对许多受试物有过度敏感的致畸反应，胎仔小。

犬：季节性繁殖，多近亲繁殖，历史背景资料不足。

非人灵长类动物：与其他种属动物一样，其药代动力学情况与人不同，历史背景资料不足，常常因为其只数太少而难以进行危险性评估。更适合用于进行明确生殖毒性物质（该毒性已比较肯定）特性的试验研究，而不是评估其危险性。

注释3：整体动物以外的其他试验系统

已经建立了一些整体动物以外的其他试验系统，并在预试验研究（“预筛选”或“优先选择”）和后续试验研究中采用。为对同系的一组受试物进行预试验，研究清楚其中至少一种受试物对整体动物的可能作用较为重要（可推断其作用）。据此，可选择一些受试物进行更进一步的试验。

从后续研究或进一步明确受试物的作用特征上考虑，其他试验系统可能有助于详细研究某些可观察到的发育过程，例如，揭示具体毒性机理、明确（药物）浓度-反应关系、选择“敏感（生长发育）阶段”，或检测已知代谢产物的作用。

注释4：剂量选择

剂量选择是生殖毒性试验设计的关键问题之一。可根据已有的研究资料来选择高剂量，如果已有资料信息不足，应进行预试验。大约2～4周重复给药毒性试验研究的周期，与各段生殖毒性研究设计的很接近。若选择与重复给药毒性研究相似的剂量，可参考全身毒性表现，以分析对生育力方面的影响。

生殖毒性研究中存在许多可变因素，剂量-反应关系趋势的存在与否，是判断效应与药物相关性的一个关键性依据。由于剂量-反应关系曲线可能是陡直的，故不建议设计宽的剂量间距。若试图通过一项研究来分析效应的剂量-反应关系，应至少设三个剂量组和适当的对照组。若还不能确定其剂量-反应关系，应增设剂量组，避免剂量间距过大，并应确定生殖毒性方面“未观察到不良反应的剂量水平”。

在剂量选择时参考药代动力学研究结果是重要的，若剂量的增加并不导致血浆和组织中浓度的升高，则增加剂量的意义很小。剂量间距的大小取决于药代动力学和其他毒性研究结果。应优先考虑尽量小的剂量间距。

注释5：给药途径选择

通常，给药途径与临床拟用途径一致，但如果药代动力学研究结果显示，某种给药途径下机体中的暴露量（如AUC）更高，此时，选用暴露量更小或实际操作相当困难的给药途径（如吸入给药）的意义可能较小。

经口给药，通常使用灌胃给药法。掺食法（饲料/饮水）给药时，往往达不到预期剂量或不能准确给药，因此一般不采用。

注射给药，应注意受试物的性状及其局部安全性。静脉注射时，应注意控制注射速度，防止药液泄漏。腹腔注射时可能会对子宫或胎仔直接产生作用，故采用妊娠动物进行试验时，一般不用该途径。

有时也可采用皮下或肌内注射途径。

对于临床上局部应用（皮肤、眼、耳等）的受试物，可采用其他的给药途径替代。皮肤给药时，应避免动物舔食、与笼子摩擦和剃毛时的皮肤损伤。皮肤给药的替代途径，可采用吸收途径类似的皮下注射。

当选择的给药途径与临床拟用途径不同时，应说明依据。

注释6：试验方案选择

    对于化学药物来说，如果给药剂量达2g/kg而不致死，且重复给药毒性试验剂量达1g/kg时未出现毒性，可仅进行单项包括两代的生殖毒性试验，包括两受试物组（0.5 g/kg和1.0 g/kg）与一个对照组。但应关注种属动物选择的合理性以及受试物有效性。

此外，对多巴胺受体激动剂或减少循环中催乳素水平的受试物，雌性大鼠为较差的模型动物，而家兔可能是用于上述受试物所有生殖毒性研究的更好的动物种属，但目前似乎尚未进行这种尝试。若有证据显示家兔的代谢方式比大鼠与人更接近，则家兔也可用于其他类型受试物的生殖毒性研究。

注释7：常规试验与后续试验

    常规试验（指导原则规定的试验）在不同程度上具有难以判断的特点，即对某一指标影响的产生，可能有多种不同原因。例如，出生时每窝幼仔数的减少可能是因为排卵率（黄体数）的减少、着床前死亡率的提高，或因为着床后死亡率或出生后立即死亡率的增加所致。而上述死亡可能是其早期胎体畸形的后果，由于随后的继发性改变等原因，该畸形不能够再观察到。尤其是那些在对照组中已表现出的低发生率的反应，给药所致影响与偶然出现的情况间的区别，就要根据其与其他类型影响的关系来判断。因此，若发现对某一指标的影响，应考虑进行后续试验以探索其可能的联系，明确其毒性的性质、范围和原因，也包括判断其剂量-反应关系以便有助于其危险性评价。这不同于常规试验的情况，此时剂量-反应关系存在与否，将有助于区别给药所致影响与偶然情况的不同。

注释8：计时方法

本指导原则中，妊娠的计时方法为以观察到阴道涂片精子阳性和/或阴栓的日期计为妊娠第0天。大鼠和家兔的着床发生在妊娠的第6～7天，硬腭闭合在第15～18天。

其他计时方法也可接受，但必须在报告中明确说明。另外，研究者必须在不同的研究中保持计时方法的一致性，以确保给药过程中不出现空隙。建议在相关研究的给药期之间，应设计至少一天的重叠期。

交配时间会影响胎仔和幼仔相关参数的变异性，应确认准确的交配时间。

通常，幼仔动物的出生日即计为产后或哺乳的第0天。可借助准确的交配日期来判断是否出现分娩延迟或滞产。

注释9：动物数

对动物数的要求，总体原则是满足数据分析的需要。考虑到国内的现实情况，本指导原则中仍然保留了对动物数的最低要求。该要求主要参考了ICH相关会议纪要中美国、欧盟、日本对动物数要求。

注释10：给药时间

生育力试验，尤其减少雄性动物交配前给药期，应根据前期试验所积累的资料以及对精子发生过程基础研究的再评价而设计（对精子发生的研究以往尤其要求较长的交配前给药期）。但选择性影响雄性生殖功能的受试物是罕见的，通过与雌性动物交配来观察受试物对精子发生影响这一方法是不灵敏的；而充分的雄性动物生殖器官病理学和组织病理学检查(如通过Bouin's固定、石蜡包埋、睾丸2～4 µm横切片，附睾纵切片，PAS和苏木素染色)则是检查对精子发生的影响的一种更为敏感和快捷的方法。影响精子发生的受试物一般作用于分裂后期。尚无仅通过雄性动物给药9～10周并与雌性交配，来发现雄性生殖方面毒性的有说服力的例子（试验）。生育力试验可对重复给药毒性试验中组织学检查不能观察到的受试物对雄性生育力的功能性影响，以及对雌雄动物交配行为的影响进行评价。

重复给药试验可提供受试物对精子发生的潜在影响的信息。评价对精子的影响应参考至少1个月的重复给药毒性试验的结果。如果在1个月以上的重复给药毒性试验中未发现任何毒副作用，那么在交配前雄性动物给药周期可缩短至4周。

已有研究显示大鼠精子发生（包括精子成熟）整个过程需63天，若已有的资料提示生育力的研究范围需扩大或需明确其作用性质，则应合理设计试验以对其进行进一步的研究。

注释11：动物处理

雌雄动物比例：雌雄动物最好以1:1比例进行交配，因为不管是为了取得高的受孕率还是为了避免试验结果的错误分析和阐述，这都是最安全的方法。

交配时期和方法：大部分实验室采用2～3周的交配期。 在一些实验室中，一旦阴道涂片阳性或查到阴栓即将雌性动物移走，而另一些实验室则继续使雌雄动物同笼。大部分大鼠在同笼的最初5天内即可交配（在第1个动情期内），但某些雌鼠可能出现假孕。在此情况下，可将雌雄大鼠同笼约20天，使雌性动物重新开始动情期以受孕。

终末处死：如果雌性大鼠在胚胎着床后停止给药，在其妊娠13～15天时处死，通常可满足评价对生育力和生殖功能影响的需要，例如可区分着床与吸收胎。为观察不良反应（在生育力研究中没有必要），获得后期胚胎丢失、胎仔死亡或结构畸形等资料，雌性动物一般在妊娠20/21天处死，雄性动物建议在交配成功后处死。结果模棱两可时，可将雄性动物与未给药的雌性动物进行交配以检查雄性动物是否有生育能力。

注释12：观察指标

本指导原则中仅列出常规指标，应根据受试物、临床适应症、用药人群特点等具体情况，增加相关观察指标。

给药期间每日对妊娠动物称重是有意义的。对某些受试物，在非妊娠期（交配前、交配期与哺乳期）则最好每周称重2次以上。

对明显未妊娠的大鼠或小鼠（不包括家兔），可进行子宫硫化胺染色，以确定是否有胚胎死亡。

注释13：胚胎-胎仔发育毒性试验中的第二种动物

通常胚胎-胎仔发育毒性带来的后果相对更为严重，故对其试验结果应更为关注。采用多种动物进行试验，在将试验结果外推至人时可能会有更为充分的试验依据。通常，胚胎-胎仔发育毒性试验需要采用至少两种动物进行，推荐采用大鼠和家兔。

注释14：体格发育、感觉功能、反射和行为

评价体格发育的最佳指标为体重。离乳前体格发育的标志如耳廓张开、毛发生长、门齿萌出等均与胎仔体重具有高度相关性。胎仔体重与交配后时间的相关性大于体重与出生时间之间的相关性。平面翻正反射、听觉惊跳反射、空中翻正反射和对光反射等依赖于身体发育的状况。

离乳后体格发育的两项明显标志是雌鼠阴道张开和雄鼠龟头包皮腺裂开。后者与睾酮水平升高有关，而睾丸下降与睾丸酮水平无关。这些标志意味着性成熟的开始。

功能测试：至今为止，功能测定绝大多数为行为试验，虽然人们已在此方面花费了很多精力，但尚未找到可推荐的特异性测试方法。研究者们正努力寻找可测试感觉功能、自主活动、学习和记忆的方法。

注释15：生殖毒性研究的阶段性

胚胎-胎仔发育毒性带来的后果相对更为严重，对该段试验结果应更为关注，如果采用多种动物进行试验，在将试验结果外推至人时可能会提供更为充分的试验依据。

考虑到目前我国的现状，由于创新药物没有或仅有较少的可以参考的资料，需要更加关注对人体安全性。为了将受试者（及其后代）的风险降至最低，并为合理用药、利弊权衡提供参考，在临床研究开始前应尽可能了解受试物对雌雄动物生殖能力、生殖器官、生殖细胞以及早期胚胎发育的影响。因此，目前要求生育力与早期胚胎发育毒性试验和胚胎-胎仔发育毒性试验在临床试验开始前完成。

在某些特殊情况下，如用于艾滋病、晚期恶性肿瘤等治疗的药物以及用于生殖控制、孕妇等特殊人群的药物，可灵活考虑生殖毒性的要求，如研究内容和具体设计、动物种属和阶段性等。

此外，在常规试验后，发现了某些不良影响，为弄清该影响的实质及其发生的机理而外推至人，进行适当的后续试验是很重要的。对于后续试验的时间安排应视具体情况灵活掌握。

附件四

细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究

技术指导原则

细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则

一、概述

细胞毒类抗肿瘤药物是指能够直接杀伤肿瘤细胞或抑制肿瘤细胞生长、增殖的一类化疗药物，作用机制包括抑制肿瘤细胞核酸或蛋白质的合成、干扰大分子物质代谢、干扰微管系统、抑制拓扑异构酶等。

细胞毒类抗肿瘤药物是目前治疗恶性肿瘤的主要手段之一。此类药物在杀灭或抑制肿瘤细胞的同时，也会对机体的正常细胞（尤其是代谢旺盛的细胞）产生影响，通常在药效剂量下就会导致病人出现不良反应。此类药物的上述特点决定了其非临床研究与其他药物相比，具有一定的特殊性。

本指导原则仅代表目前对细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究的一般性认识，旨在为细胞毒类抗肿瘤药物的非临床研究提供技术指导和参考。由于指导原则不可能涵盖细胞毒类抗肿瘤药物开发中的所有情况，所以具体药物的非临床研究应在本指导原则的基础上，根据药物的自身特点制订研究方案。

本指导原则主要适用于创新性细胞毒类抗肿瘤化学药物（见注释1），内容重点阐述细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究的特殊性，凡与既往颁布指导原则内容重复的部分，文中不再赘述，请参照有关指导原则执行。

二、有效性研究

细胞毒类抗肿瘤药物有效性研究的目的主要是探索受试物的作用机制、作用强度以及对不同类型肿瘤的敏感性等，为安全性评价以及临床试验中给药方案、瘤种的选择等提供参考信息。

由于研究方法的局限性，目前细胞毒类抗肿瘤药物有效性研究的结果并不能准确地预测受试物的临床疗效。注册申请人应充分意识到细胞毒类抗肿瘤药物有效性研究的不确定性，及其为药物研发带来的风险。在有效性试验中应重视探索药物的作用机制，使模型尽可能模拟临床肿瘤病人的实际情况，以降低开发风险。

（一）体外试验

体外试验主要用于筛选候选化合物，初步了解受试物的作用机制、敏感肿瘤类型和作用强度，为随后进行的体内试验提供参考。

作用机制研究（如药物作用靶点、细胞周期特异性等）对于预测受试物的有效性和安全性，完善非临床和临床试验的设计具有重要意义，此部分研究应伴随开发进程不断深入。对于创新性药物，必要的作用机制研究资料应在申请临床试验时提交。

在体外培养的不同人肿瘤细胞系中加入不同浓度的受试物，采用磺酰罗丹明染色法（SRB法）、四氮唑盐还原法（MTT法）、集落形成法、台盼兰染色法等方法进行检测，计算受试物的半数抑制浓度（IC50），并与阳性对照药进行比较，可初步预测受试物的作用强度和对不同类型肿瘤细胞的敏感性。应根据受试物的结构特点、理化性质和作用机制确定体外试验采用的研究方法。例如，以线粒体为作用靶点的受试物不宜采用四氮唑盐还原法。

在选择肿瘤细胞系时应考虑到细胞的生长和增殖速率。除非有充分证据证明受试物仅作用于特定的人体细胞靶点，一般应至少选用12种人癌细胞系进行试验。试验还应考察受试物对耐药肿瘤细胞系和正常人源细胞的作用和影响。受试物与细胞共培养的时间一般为48~72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性和阴性对照组，阳性对照为化学结构类似，具有相同或类似作用机制的抗肿瘤药物，阴性对照为溶媒对照。试验至少应重复一次。

   （二）体内试验

体内试验用于进一步考察受试物对特定类型肿瘤细胞的杀伤或抑制作用，探索受试物产生药效作用的给药剂量、途径、频率和周期等。

体内试验通常采用动物肿瘤移植模型和人癌异体移植模型。由于动物肿瘤移植模型与临床疗效之间的相关性不强，仅可用于候选化合物的初步筛选。通常情况下，以人癌异体移植模型试验结果来评价细胞毒类抗肿瘤药物的有效性。

1、模型建立

人癌异体移植模型试验通常在无胸腺鼠或联合免疫缺陷小鼠体内移植人癌细胞系，观察受试物对肿瘤生长的抑制作用。移植肿瘤的选择主要参考体外试验结果、细胞系的生物学特点等因素。原则上，应尽量选用多种人癌异体移植瘤模型；移植的人癌细胞系在组织学、基因表达特点、耐药性等方面应与人体肿瘤尽量接近。

细胞毒类抗肿瘤药物临床前体内试验一般至少应选用3～4种人癌异体移植瘤模型，试验至少应重复一次。人癌细胞系移植成瘤后，应传2~3代后再用于体内抗肿瘤试验。为了保持移植瘤的生物学特性和遗传特性，移植瘤体内传代应少于15~20代。

2、试验设计

。肿瘤移植部位主要在皮下，也包括原位和腹腔等。通常待移植肿瘤生长至少达100mm3后，再将动物随机分组给药。一般包括高、中、低3个剂量的给药组、阳性对照组和阴性对照组。每组至少6只动物。给药组受试物剂量的选择应体现出量效关系，高剂量不宜超过受试物的最大耐受量（见注释2）。应根据受试物的药动学特点和毒性反应等确定给药频率和周期；给药途径尽量与推荐临床用药的途径相同。阳性对照药一般需满足以下条件：（1）与受试物结构类似，作用机制相同或相近；（2）对移植肿瘤敏感；（3）临床广泛应用且疗效确切。阳性对照药的给药方案应体现出最佳治疗作用，其剂量一般不宜超过最大耐受量。阴性对照组给予相应的溶剂或辅料。

3、检测指标

推荐使用测量瘤径的方法，动态观察受试物的抗肿瘤效应。肿瘤直径的测量次数根据移植瘤的生长情况而定，一般为每周2~3次。在试验中还应观测与药物安全性有关的指标，如动物体重增长和死亡率，将治疗组的数据与阳性对照组进行比较，对于判断受试物的安全性和开发前景具有重要意义。试验中应记录检测指标的变化与给药时间的关系，以便了解受试物的作用特点，减少单次记录试验结果可能引起的误差。体内抗肿瘤试验结果中应尽可能附有相应的照片。

免疫缺陷小鼠皮下移植的肿瘤很少发生转移，多数死于原发肿瘤。而临床肿瘤病人大多死于肿瘤转移，动物和临床肿瘤病人的死亡原因不同。因此，对于人癌异体移植试验，生命延长率并不是理想的观测指标。

4、评价标准

对于体内试验结果的评价应综合考虑受试物的作用机制、模型的临床相关性、每一种模型的具体试验结果以及受试物与阳性对照药试验结果的比较。

针对人癌异体移植瘤模型，推荐采用相对肿瘤增殖率T/C（%）（见注释3）作为试验评价指标。原则上，评价标准为：T/C（%）>40 %为无效；T/C（%） ≤40%，并经统计学处理P < 0.05为有效。在体内有效性试验采用的全部人癌异体移植瘤模型中，一般至少应有3种达到有效标准，才提示受试物有必要进入临床试验。

在评价时还应特别关注受试物与阳性对照药试验结果的比较。在毒性相当（在有效性研究中主要表现为动物死亡率和体重下降相当）的情况下，对治疗组和阳性对照组肿瘤增殖率的比较也是评价受试物是否有必要进入临床试验的重要指标之一。

（三）药代动力学

有效剂量下的药代动力学行为是阐明药物有效性的基础之一。测定受试物发挥药效时的暴露量（见注释4），与毒代动力学数据比较，有助于判断受试物的安全范围；与人体药动学参数进行比较，有助于在临床试验早期预测受试物的有效性和进一步调整临床试验的给药方案，因此应在临床前测定受试物发挥药效时原型或活性代谢产物的暴露量。应着重关注受试物在毒性靶器官和肿瘤组织中的分布。

对于细胞毒类抗肿瘤药物的特殊给药体系（如脂质体、乳剂等），其药动学研究的重点在于与普通制剂或已上市特殊给药体系的比较，包括药动学参数和药物组织分布的比较。如果受试物设计为肿瘤靶向制剂，应测定模型动物肿瘤组织中的药物浓度，以初步提示是否达到肿瘤靶向的设计目的。应关注药动学行为差异可能导致的毒性反应的不同，并进行必要的安全性研究。

三、安全性研究

细胞毒类抗肿瘤药物的毒性易发生于代谢旺盛的组织，通常毒性作用大，安全范围小，具有蓄积性和延迟性，因此与其他化学药物相比，其安全性研究具有一定的灵活性和特殊性。

细胞毒类抗肿瘤药物非临床安全性研究的目的主要包括：（1）估算I期临床试验的起始剂量；（2）预测受试物的毒性靶器官或靶组织；（3）预测受试物毒性反应的性质、程度和可逆性；（4）为临床试验方案的制订提供参考。

本指导原则中非临床安全性研究的各项要求的提出，很大程度上是基于目前肿瘤病人缺少有效临床治疗手段，预期生存期较短。但事实上，不同类型肿瘤的临床治疗现状并不完全一致。因此在对具体的药物进行安全性研究时，应考虑到临床拟定适应症和用药人群的特点，不能简单套用。

（一）急性毒性试验

细胞毒类抗肿瘤药物急性毒性试验的主要目的是考察受试物的毒性作用，了解其毒性靶器官，并测定其最大耐受量。试验应分别采用啮齿类和非啮齿类动物进行，给药途径尽可能与临床拟用的给药途径相同，恢复期至少为14天。经结构改造获得的化合物或特殊给药体系应进行与母体化合物或原剂型对比的急性毒性试验。

建议在急性毒性试验中进行毒代动力学研究。

（二）长期毒性试验

细胞毒类抗肿瘤药物长期毒性试验的主要目的在于估算I期临床试验的起始剂量，预测受试物的毒性靶器官、毒性的性质、程度、剂量反应关系和可逆性。与其他药物比较，细胞毒类抗肿瘤药物的长期毒性试验更关注受试物的最大耐受量。

细胞毒类抗肿瘤药物长期毒性试验的设计应充分考虑到受试物自身的特点。应根据受试物不同的生物学特点选择合适的试验动物，试验一般分别采用啮齿类和非啮齿类动物进行。试验一般至少设立高、中、低三个剂量给药组和一个溶媒（或辅料）对照组。经结构改造获得的化合物或特殊给药体系应考虑增加母体化合物或原剂型对照组。试验给药剂量应统一按体表面积表示。高剂量应充分暴露受试物的毒性反应，并尽量寻找到受试物的最大耐受量；低剂量应可引起动物出现较轻的毒性反应。给药途径和给药方式（例如静脉滴注和静脉注射等）应尽量与临床拟定的用法一致。由于细胞毒类抗肿瘤药物可能具有蓄积或延迟毒性，长期毒性试验的恢复期一般不应短于28天。

在细胞毒类抗肿瘤药物的开发过程中，推荐选择用不同给药期限的长期毒性试验来分别支持不同阶段的临床试验，以降低开发风险。也可以在临床前完成支持药物上市的长期毒性试验。

通常，注册申请人应在临床试验前完成啮齿类和非啮齿类动物连续给药至少2个给药循环或4周的重复给药试验。虽然申请人在临床I/II期试验中常常会探索不同的给药方案，但原则上，支持受试物进行I/II期临床试验的长期毒性试验的给药期限不应短于临床试验周期，给药间隔不能长于临床试验中的最短给药间隔。在III期临床试验前，申请人应完成给药期限通常为6~8个给药循环或6个月的重复给药毒性试验，试验的给药频率应尽量与拟定的III期临床试验用药频率相同。

除常规观测指标外，长期毒性试验应根据受试物特点、文献报道和同类药物已知的临床不良反应（如骨髓毒性、神经毒性、胃肠道毒性、心脏毒性等），设计具有针对性的观测指标或进行进一步的研究。

（三）一般药理学试验

一般药理学试验主要是研究受试物在治疗范围内或治疗范围以上剂量时，对生理功能的潜在不良影响。细胞毒类抗肿瘤药物需在临床试验前完成一般药理学试验。

（四）局部刺激性试验

细胞毒类抗肿瘤药物可能直接对用药局部产生毒性作用，应在I期临床试验前完成临床拟用途径的局部刺激性试验。此项试验可单独进行，也可结合长期毒性试验进行。

（五）遗传毒性、生殖毒性和致癌性试验

由于细胞毒类抗肿瘤药物通常首先在没有其他治疗手段的受试者中进行临床试验，因此遗传毒性试验并不一定在临床前完成。

细胞毒类抗肿瘤药物的作用机制决定了其很可能具有生殖毒性，鉴于其主要用于晚期肿瘤病人，因此可不进行生殖毒性试验。

由于临床用药人群的预期生存期较短，细胞毒类抗肿瘤药物通常也不需要进行致癌性试验。

（六）毒代动力学

毒代动力学结果既可以描述实验动物的暴露量与给药剂量、暴露时间和毒理学结果之间的关系，也可用于估算受试物的安全范围，为I期临床耐受性试验设计提供参考。细胞毒类抗肿瘤药物应在长期毒性试验中进行毒代动力学研究。

四、非临床研究向临床试验的过渡

药物非临床研究的最终目的是预测受试物的临床有效性和安全性，判断其能否进入临床试验，并为临床试验的设计和临床合理用药提供参考。细胞毒类抗肿瘤药物应尤其关注以下两点：

（一）关于临床试验起始剂量

如前所述，细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究的目的之一是估算安全的I期临床试验起始剂量。长期毒性试验中测得的受试物的最大耐受量（按体表面积计算）是估算I期临床试验起始剂量的重要因素之一。通常I期临床试验起始剂量不应高于啮齿类动物最大耐受量的1/10和非啮齿类动物最大耐受量的1/6。在估算I期临床试验起始剂量时，还应同时考虑到动物和人体之间生理、生化以及药代动力学等方面的差异。

（二）关于临床试验瘤种

细胞毒类抗肿瘤药物需要通过II期临床试验中的瘤种筛选，最终确定拟开发的临床适应症。非临床有效性研究结果是II期临床试验筛选瘤种的依据之一。

药物研发目的不同（如针对某一适应症筛选化合物、针对某一化合物筛选适应症、已上市药物结构修饰等）会影响非临床研究方案的设计。不同的研究方案可能会为II期临床试验瘤种的筛选提供不同的支持信息。需在对I期临床试验研究结果、受试物的作用机制、同类药物的临床适应症、非临床有效性研究结果等进行综合评价的基础上，确定II期临床试验拟筛选的瘤种。

五、结语

细胞毒类抗肿瘤药物的特点决定了其非临床研究具有一定的特殊性和灵活性。在此类药物非临床研究的过程中，注册申请人应充分意识到药物的开发风险（尤其是有效性风险）。并在充分认识药物适应症和自身特点的基础上，遵循“以科学为基础，具体问题具体分析”的原则，有序开展研发工作。

六、注释

    1、创新性细胞毒类抗肿瘤药物：本文中创新性细胞毒类抗肿瘤药物不包括已在国外进入III期临床试验的药物。

    2、最大耐受量（Maximal tolerance dose, MTD）：不引起受试动物死亡的最高给药剂量。

3、相对肿瘤增殖率T/C（%）：针对每一种人癌异体移植瘤模型的抗肿瘤活性评价指标。计算公式如下：T/C % = TRTV / CRTV*100%。（TRTV：治疗组RTV ；CRTV：阴性对照组RTV）。

肿瘤体积(tumor volume,TV)的计算公式为：V  = 1/2×a×b2。其中a和b分别表示长和宽。根据测量的结果计算出相对肿瘤体积（relative tumor volume，RTV），计算公式为： RTV = Vt / V0。其中V0为分笼给药时(即d0)测量所得肿瘤体积，Vt为每一次测量时的肿瘤体积。

4、药物暴露量：通常用药代动力学参数进行描述，反映动物局部或全身负载的受试物和/或其代谢产物。最常用的参数包括药时曲线下面积（AUC）和/或达峰浓度（Cmax）。特殊情况下，其他参数可能更适用。

七、参考文献

1.     Beverly A. Teicher etal. Anticancer Drug Development Guide: Preclinical Screening, Clinical Trials, and Approval (Second Edition). Human Press, 2004.

2.     Theodora Voskoglou-Nomikos, etal. Clinical Predictive Value of the in Vitro Cell Line, Human Xenograft, and Mouse Allograft Preclinical Cancer Models. Clinical Cancer Research (2003), 9, 4227–4239.

3.     JI Johnson, etal. Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials   British Journal of Cancer, 2001, 84：1424–1431.

4.     L.R. Kelland. ‘‘Of mice and men’’: values and liabilities of the athymic nude mouse model in anticancer drug development. European Journal of Cancer (2004), 40: 827–836.

5.     Willem Den Otter, etal. Testing Therapeutic Potency of Anticancer Drugs in Animal Studies: A Commentary. Regulatory Toxicology and Pharmacology(2002), 35, 266-272.

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9.     Japanese Administrative Notification. Q& A on the Toxicology Studies for Clinical Studies and NDA of Anti-Cancer Agents. 2004

10.  韩锐、孙燕. 新世纪癌的化学预防与药物治疗. 人民军医出版社，2005.

八、著者

《细胞毒类抗肿瘤药物非临床研究技术指导原则》课题研究组

zyd24

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