联苯苄唑溶液微生物限度检查法方法学研究

大上海

联苯苄唑溶液微生物限度检查法方法学研究

建立联苯苄唑溶液微生物限度检查方法——需氧菌和霉菌、酵母菌采用薄膜过滤法，控制菌铜绿假单胞菌采用平皿法，金黄色葡萄球菌采用薄膜过滤法。经采用薄膜过滤法需氧菌和霉菌、酵母菌、金黄色葡萄球菌回收率应不低于70%，铜绿假单胞菌回收率不低于70%。本次微生物限度检查法方法学研究，为外用溶液剂的微生物检查提供了参考依据。
文/ 刘九平，曾叶萍

溶液剂是药物制剂中应用广泛的一种剂型，由药物溶解于适宜溶剂（如：水、乙醇、植物油或其他液体）中制成，因其有着质量稳定，剂量小，携带、用药方便等特点，深受广大患者喜爱。联苯苄唑溶液为外用溶液剂，是药典收载品种［1］抗真菌药，适应症为：用于治疗各种皮肤真菌病，如手、足癣，体、股癣，花斑癣等。为建立联苯苄唑溶液的微生物检查方法，特进行本次联苯苄唑溶液微生物检查法方法学研究，为联苯苄唑溶液微生物［2］的检查提供依据，同时也为外用溶液剂的微生物检查法［3］方法学研究提供参考依据。

微生物限度检查法方法
取联苯苄唑溶液依法检查（《中国药典》2015年版四部通则1105、1106），需氧菌总数检查为薄膜过滤法（取供试品10 g，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀使之溶解。取1：10供试液1 mL采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL分5次冲洗），霉菌和酵母菌总数检查为薄膜过滤法（取供试品10 g，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀使之溶解。取1：10供试液1 mL采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗），金黄色葡萄球菌检查为薄膜过滤法（取1：10供试液10 mL采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，每次100 mL）、铜绿假单胞菌检查为平皿法（100 mL）均应符合规定。

菌液制备
取上述经35℃培养18～24h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌的新鲜胰酪大豆胨液体培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液，做活菌计数备用。
取经25℃培养24～72 h的白色念珠菌沙氏葡萄糖液体培养物，用0.9%无菌氯化钠溶液稀释制成每1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液，做活菌计数备用。
取经25℃培养一周的黑曲霉沙氏葡萄糖琼脂培养物，加5mL含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液洗下黑曲霉孢子，洗取出孢子悬液1 mL，用含0.05%（mL/mL）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成1 mL含菌数不大于100 CFU的菌悬液。

需氧菌计数法
供试液的制备：取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀使溶解，作为1：10供试液。
回收率测定：薄膜过滤法
试验组：取供试液1 mL，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL，分5次冲洗，一筒加入含菌量不大于100 CFU铜绿假单胞菌试验菌1 mL，另一筒加入含菌量不大于100 CFU金黄色葡萄球菌试验菌1 mL，第三筒加入含菌量不大于100 CFU枯草芽孢菌试验菌1 mL（试验菌均在最后一次冲洗中加入）取出滤膜置胰酪大豆胨琼脂培养基贴膜培养，30℃～35℃培养24～120 h逐日观察结果。
菌液组：取45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL加入微生物限度检查专用滤器抽滤，一筒加入含菌量不大于100 CFU铜绿假单胞菌1 mL，另一筒加入含菌量不大于100 CFU金黄色葡萄球菌1 mL，第三筒加入含菌量不大于100 CFU枯草芽孢菌1 mL，立即贴膜于胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿内，30～35℃培养24～120 h逐日观察结果。
供试品：取供试液1 mL，用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL，分5次冲洗，立即贴膜于倾注胰酪大豆胨琼脂培养基的平皿中，置35℃培养24～120 h逐日观察结果。（取1：10供试液1 mL，采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液500 mL分5次冲洗，依照该法进行检查）。
按如下公式计算试验组的加菌回收率：

结果为该株阳性菌的回收率，回收率应不低于70%。结果见表1。

霉菌、酵母菌计数法
供试液的制备：取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100 mL，摇匀使溶解，作为1：10供试液。
回收率的测定：薄膜过滤法
试验组：取1：10供试液10 mL，用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗，一筒加入含菌量不大于100 CFU白色念珠菌，另一筒加入含菌量不大于100 CFU黑曲霉菌试验，取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养，23～28℃培养24～168 h逐日观察结果。
菌液组：取45℃含2%吐温80的用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗，一筒加入含菌量不大于100 CFU白色念珠菌，另一筒加入含菌量不大于100 CFU黑曲霉菌试验，取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养，23～28℃培养24～168 h逐日观察结果。
供试品对照组：取供试液1：10供试液10 mL，用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗，取出滤膜置沙氏葡萄糖琼脂培养基贴膜培养，23～28℃培养24～168 h逐日观察结果。（取1：10供试液10 mL，采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液800 mL分8次冲洗，依照该法进行检查）。
按如下公式计算试验组的加菌回收率：

结果为该株阳性菌的回收率，回收率应不低于70%。结果见下表2。

控制菌检查方法
金黄色葡萄球菌的检查法：薄膜过滤法
供试液制备：取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL，摇匀使溶解，作为1：10供试液。
试验组：取1：10供试液10 mL，采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，每次100 mL。同时加入上述金黄色葡萄球菌液不大于100 CFU，取膜加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24 h，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72 h，观察。（取1：10供试液10 mL，采用薄膜过滤法，每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，取膜加入至100 mL胰酪大豆胨液体培养基内，依法检查）。
阴性对照组：每筒用45℃含2%吐温80的pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，每次100mL。取膜加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35℃培养24 h划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72 h，观察结果见表3。
铜绿假单胞菌的检查法：平皿法
供试液制备：取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL混匀，作为1：10供试液。
试验组：取1：10供试液10 mL加入100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，35℃培养24 h，观察。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72 h，观察结果。（取1：10供试液10 mL，采用平皿法，加入至100 mL胰酪大豆胨液体培养基内，依照该法进行检查）。

阴性对照组：取供试液10 mL，加入100 mL的胰酪大豆胨液体培养基中，摇匀，35℃培养24 h，观察。取上述培养物，划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基的平板上，35℃培养24～72 h，观察结果见表4。

结论
经过对联苯苄唑溶液外用溶液剂微生物限度检查法方法学研究试验，试验过程各检查法可操作性强，数据重现性好、方法可靠，为外用溶液剂微生物限度的检查提供了参考依据。

[参考文献]
［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典：二部.北京：中国医药科技出版社，2015：1264.
［2］国家药典委员会.中华人民共和国药典：四部.北京：中国医药科技出版社，2015：140～149.
［3］中国药品生物制品检定所，中国药品检验总所.中国药品检验标准操作规程（2010年版）：中国医药科技出版社：49.

syhorchid

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