小奕说药 | 浅谈医学领域“新宠”治疗性寡核苷酸药物的分析方法

奕安济世生物药

核酸药物，顾名思义是以核酸分子为核心设计而成，通过直接干预遗传物质转录和调控过程来实现治疗疾病的目的。近两年来，核酸药物被认为是继小分子药物、抗体药物之后的第三代创新药物，是生物医药发展的前沿领域。根据其作用机制和应用领域的区别，核酸药物又可分为小核酸药物、小分子核苷类药物和mRNA疫苗等。

小核酸药物是指长度小于30nt的寡核苷酸序列，包括小干扰核酸(siRNA)、微小RNA(miRNA)、反义核苷酸(ASO)和核酸适配体(Aptamer)等。这些药物通过与靶分子的RNA结合，抑制其翻译或调控，从而达到治疗的效果。小核酸药物具有高度的靶向性和特异性，可以精准地调控基因表达，因此在基因治疗和基因编辑等领域具有广阔的应用前景。

下表是近年来FDA批准的小核酸药物，主要用于治疗罕见病。

表1. FDA批准的小核酸药物

绝大部分寡核苷酸都是利用自动化的设备通过固相亚磷酰胺化学法来进行合成。在合成过程中，每步反应效率都不可能达到100%，所以在全长寡核苷酸序列中，会存在部分n-1、n+1等杂质，这些杂质的结构和序列均与全长药物的相似度较高。未经修饰的寡核苷酸药物在体内会被核酸酶迅速降解，成药性不理想。因此，为了达到临床效果，增强寡核苷酸的药物特性，通常会对其进行化学改造和修饰。常见的如引入了硫代磷酯键进行骨架修饰以抵抗核酸酶的降解、增加2，-O-Me修饰以提高靶向亲和力等。高度修饰的寡核苷酸对杂质的分析带来了极大的挑战，生产后的纯化、杂质和结构变异体的表征、药代动力学和药物制剂的研究都需要色谱分析，若使用单一的方法难以得到较好的分析，使用多种色谱分析可以克服相似分析物之间峰型展宽和低分离度的挑战。

对于寡核苷酸药物，离子对反相色谱法（IP-RP）是首选的纯度分析方法。由于寡核苷酸药物的分子量较大，且携带多个负电荷，亲水性较强，需要使用三乙胺等离子对试剂，来改善其在反相色谱上的保留，配合使用六氟异丙醇（HFIP），还可以实现质谱兼容。

在进行IP-RP分析时，离子对试剂（IPRs）的种类、浓度、柱温、流动相pH值等多种因素均会影响其分离效果。根据所需分析物的电荷性质，通常使用两类经典离子对试剂：

直链季铵盐：带正电荷，用于吸引阴离子分析物，加入流动相中可以增强阴离子型分析物的保留，如三乙胺，四丁基溴化铵等。

烷基磺酸盐：带负电荷，可与阳离子分析物结合，加入流动相中可以增强阳离子型分析物的保留。比如十二烷基磺酸钠，辛烷磺酸钠等。

当IP-RP与质谱耦合时，通常需要降低流动相内的IPR浓度，因为高浓度的IPR会降低质谱的离子化效率，而流动相添加HFIP可以通过其增加ESI表面电荷来提高离子化效率。在流动相中同时使用TEA和HFIP已经证明可以分析一系列寡核苷酸杂质，如n-1、n+1和P=O变体。

高分辨率液相色谱-质谱(LC-MS)，体积排阻色谱(SEC)和毛细管凝胶电泳(CGE)用于分析摩尔质量，寡核苷酸尺寸大小和折叠，这些属性是基于保留时间或分子量来进行鉴定。不同批次间保留时间的差异可以表明其结构或构象发生了变化。

MS与CGE或LC使用串联测序的方法可以识别较小长度(＜100nt)之间的潜在质量差异。电喷雾电离质谱(ESI-MS)是一种与色谱分离相结合的质谱技术，通过软电离技术保留了寡核苷酸的结构，再经过碰撞诱导解离，产生可预测的碎片离子。由于寡核苷酸化学修饰增多，使得质谱产生的碎片离子复杂，从而加大测序的难度。

CGE是已被用作纯度分析的定量方法，可以用于分析寡核苷酸尺寸大小和折叠。在进行分析之前，它需要在分析缓冲液中加入变性剂对寡核苷酸进行变性。当与质谱联用时，CGE会受到缓冲效应、取样偏置和阳离子内合的挑战。

SEC也可用于分析寡核苷酸的尺寸大小。对于适配体，表征构象特别重要，因为这与配体结合直接相关。SEC还可以通过分析药物递送偶联分子的流体动力学半径来研究其多分散性。但是对于寡核苷酸分析，SEC方法受到低分辨率的挑战，色谱方法必须根据被分析物的尺寸来优化固定相的孔径，以达到最佳分离。

阴离子交换色谱法（AEX）则是根据分析物在表面负电荷数量和位置的差异来进行分析。由于寡核苷酸药物骨架上的磷酸基团上带负电荷，因此AEX也是寡核苷酸纯度和杂质分析的常用方法。此外，AEX还可以一定程度上实现对硫代磷酯键修饰的寡核苷酸的立体异构分辨，为其立体异构的表征提供依据。AEX最大的缺点是与质谱不兼容。

用来表征寡核苷酸药物以确定关键属性（如序列、构象和结构）的分析策略是多方面的。表2概述了用于寡核苷酸药物分析的液相色谱柱和适用的条件。

治疗性寡核苷酸作为一类新兴的治疗方式，其潜力被不断挖掘，并引领着全球研发浪潮。未来几年分析方法的进一步发展有望克服目前存在的一些问题，从而使寡核苷酸药物的质量分析和控制更加可靠。

表2. 寡核苷酸药物分析的液相色谱柱和适用的条件

参考文献

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