直播贴——蒲公英大讲堂2015年第03期：中药鉴定的方法与思路

陈玉海

        每个物种的DNA序列都是唯一的,DNA条形码通过测定基因组上一段标准的,具有足够变异的DNA片段来实现物种鉴定。理论上这个标准的DNA序列对每个物种来讲都是独立的，每个位点有A、T、G、C四种位点的选择。15bp的DNA序列有415种组合编码，理论上可编码地球上所有物种
          在双螺旋的DNA中，分子链是由互补的核苷酸配对组成的，两条链依靠氢链结合在一起。由于氢链链数的限制，DNA的碱基排列配对方式只能是A对T（由两个氢键相连）或C对G（由三个氢链相连）。因此，一条链的碱基序列就可以决定了另一条的碱基序列，因为每一条链的碱基对和另一条链的碱基对都必须是互补的。在DNA复制时也是采用这种互补配对的原则进行的：当DNA双螺旋被展开时，每一条链都用作一个模板，通过互补的原则补齐另外的一条链，即半保留复制。
         分子链的开头部分称为3'端而结尾部分称为5'端，这些数字表示脱氧核糖中的碳原子编号。DNA的书写方式应从5'-末端到3'-末端。

陈玉海

选择标准：
               在种间有明显的遗传变异和分化, 同时种内变异足够小。种内差异最大值小于种间差异最小值。
               片段足够短, 便于一个反应完成测序工作, 而且便于DNA提取和PCR扩增, 尤其是对存在DNA降解的材料(如: 保存已久的腊叶标本、处理过的民间药材);
              序列两端相对保守, 便于设计通用引物。
              避免发夹效应。

陈玉海

                  ITS2是真核生物 rDN A 上的一段，它在物种间具有显著的差异，因此，被广泛用于物种分类及系统进化研究 “ITS2 序列具有适合扩增和测序的长度, 有利于对发生降解的样品进行扩增 。ITS2片段在物种水平的变异较快, 有更多的突变位点以区分不同的物种。因此， 在 DN A 条形码鉴定物种方面具有潜在的研究价值。

             目前，陈士林等主要依据《中国药典》, 参照《中国植物志》, 研究了 753 个属 4800 种 6600 份样品，针对7个 DNA 片段（psbA-trnH, matK,rbcL, rpoC1, ycf5,ITS,ITS2），其中，ITS2 在种水平的鉴定成功率达到了92.7%，因此提出将 ITS2 序列作为鉴定药用植物的潜在的标准序列,叶绿体psbA-trnH为辅助序列。
              动物类中药材 采用细胞色素C氧化酶亚基I(COI)为主体序列，ITS2为辅助序列。

陈玉海

操作步骤：

1.样品准备
2.提取目的基因
3.PCR
4.电泳
5.结果分析

陈玉海

PCR技术：定义：聚合酶链式反应简称PCR（Polymerase Chain Reaction）： (又称多聚酶链式反应) PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

原理：PCR是一种体外DNA 扩增技术，是在模板DNA、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，将待扩增的DNA片段与其两侧互补的寡核苷酸链引物经“高温变性——低温退火—引物延伸”三步反应的多次循环，使DNA片段在数量上呈指数增加，从而在短时间内获得我们所需的大量的特定基因片段。

陈玉海

今晚上的直播到此结束：
主持：天睦
直播：bruce2020
场控：rabbit、道尘

syhorchid

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陈玉海

参加培训共97人：