1【耀文解读】mRNA-LNP脂质组分检测：基于QbD/DoE原则开发HPLC-CAD分析方法

耀海微生物cdmo

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]导读：脂质纳米颗粒（LNP）是目前最为前沿的mRNA或siRNA递送系统，能够提高RNA的稳定性和体内递送效率。全球首款上市的RNA药物Onpattro将siRNA包裹在由DLin-MC3-DMA、DSPC、PEG2000-DMG和Cholesterol组成的LNP中；而Pfizer-BioNTech和Moderna的两款mRNA疫苗中的LNP组分分别为：mRNA1273（SM-102、PEG2000-DMG、DSPC和Cholesterol），BNT162b2（ALC-0315、ALC-0159、DSPC和Cholesterol）。对LNP中单个脂质组分进行鉴别和定量检测是RNA疫苗/疫苗开发和生产阶段的关键质量属性。

2023年9月，东国大学药学院Nam Ah Kim联合Seong Hoon Jeong团队在Journal of Chromatography A发表文章：《Optimization of HPLCCAD method for simultaneous analysis of different lipids in lipid nanoparticles with analytical QbD》。研究者基于质量源于设计（QbD）和实验设计（DoE）方法，开发并优化了HPLC-CAD分析方法以检测LNP脂质组分。一、方法学简述

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]高效液相色谱（HPLC）与电雾式检测器（CAD）结合，是检测LNP脂质组分的推荐方法。2023年，美国药典USP更新的“Analytical Procedures for mRNA Vaccine Quality”草案中建议使用CAD检测器鉴别脂质组分、定量检测各组分含量。用于药物分析的液相色谱法和CAD检测已被列入各国药典。由于CAD的高度灵敏性，可以检测更大范围的脂质含量。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为实现分析方法的开发和优化，我们需识别HPLC-CAD性能的可能影响因素。分析方法开发的典型方法是基于一次改变一个因素（OFAT）。OFAT方法需开展大量实验，而且无法评估因素之间可能存在的交互作用，因此限制了方法的开发。

近年来，分析质量源于设计（AQbD）在方法开发中的应用引起了研究人员的关注。根据ICH Q14 指南草案，AQbD 概念被解释为“分析程序开发的增强方法”。AQbD的第一步是定义分析目标概况（ATP），以确定所需的性能标准。随后进行初步风险评估，以确定可能影响性能的参数。实验设计（DoE）方法可用于研究输入参数与输出性能之间的关系，并找到最佳运行条件。最后是分析方法设计空间（MODR），确保方法的稳健性，并为高风险参数确定控制策略。二、基于QbD的HPLC-CAD方法开发以检测LNP组分

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]研究者基于AQbD和DoE方法，旨在开发稳健的HPLC-CAD分析方法以检测mRNA-LNP中各脂质组分的含量。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2.1 实验样品

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]实验用mRNA-LNP中脂质组分包括ALC-0315、DSPC、cholesterol和DMG-PEG 2000。mRNA-LNP经适当处理后，作为HPLC-CAD分析样品。

2.2 ATP和CMA的控制标准

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]首先是分析目标概况（ATP）的定义和关键方法属性（CMA）的控制标准。研究基于4种脂质组分的同步定量定义了ATP，具体为：①不同脂质组分洗脱峰之间具有足够的选择性；②准确度范围在 90-110% 之间；③精密度RSD小于 5%，④较短的分析时间。根据ATP定义衍生的关键方法属性（CMA）为液相色谱系统适用性参数，包括分辨率和保留时间，将CMA作为关键响应值进行控制，具体为：紧密洗脱峰之间的分辨率>2.0，且最后一个洗脱峰的保留时间小于 15 分钟。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]随后，研究者利用“石川鱼骨图”进行初步风险评估，并筛选了高风险因素，包括进样体积、有机溶剂类型和比例、流动相 pH 值、缓冲液浓度、流速、色谱柱类型、色谱柱温度和 CAD蒸发温度。

2.3 预实验筛选流动相和固定相

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]随后是预实验筛选流动相和固定相。由于LNPs 中的脂质组分是非极性或仅有轻微极性的物质，因此RP-HPLC中流动性类型和比例尤其重要。研究人员基于OFAT开展了预实验，筛选HPLC流动相和固定相，具体包括流动相中有机溶剂的类型（甲醇或乙腈）、有机溶剂含量、流动相pH、以及固定相色谱柱。该方法的挑战性在于如何在短时间内完全分离前三种洗脱组分DMG-PEG 2000、cholesterol和ALC-0315，使用甲醇作为有机溶剂解决了这一问题。

2.4 关键方法参数（CMPs）的识别

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]其次是关键方法参数（CMPs）的识别。采用Plackett-Burman方法，基于2水平对6个风险因子进行了评估，包括：进样体积、甲醇比例、甲酸铵浓度、流速、柱温和CAD蒸发温度。基于方差分析（ANOVA）等实验数据，甲醇比例、流速和柱温这3个CMPs被选定用于分析方法的优化。

2.5 关键方法参数（CMPs）的优化

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为优化分析方法参数（CMPs），作者采用了响应面分析（RSM），同时进行Box–Behnken分析评估因素之间的潜在交互作用。研究通过在甲醇比例、流速和柱温这3个因子的高、低水平之间加入一组中心点设计了试验，以获得曲线响应面的最优点。具体实验设计与响应值如下：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图1: 实验设计与响应值

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于以上数据进行建模，预测到甲醇浓度为96%、流速为1.2ml/min、柱温在65℃时，可以在短时间内达到预期的分离效果。进一步地，研究者开展了验证实验，色谱条件为C18色谱柱；自动进样器温度为20℃；流动相为甲醇:水（96:4, 含7.5 mM甲酸铵）；流速1.2m L/min；进样量20μL；柱温65℃；蒸发温度50℃。实验结果与预测响应值相似，证明了优化模型的可预测性和有效性。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图2: 最优参数下LNP四种脂质组分的分离效果

2.6分析方法设计空间（MODR）

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]设计空间（DS）是方法参数的一个区域范围，在该范围内色谱响应均在预期范围内。DS可通过叠加所有响应函数的等高线图来生成。文中通过上述方法确定了MODR安全范围：甲醇比例在95.5~96.5%，流速在1.1~1.3 mL/min，色谱柱温度在63~65°C。同时，通过实验验证了MODR边缘条件下方法的稳健性。

2.7 HPLC-CAD分析方法验证

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]根据ICH指南，研究者对HPLC-CAD分析方法进行了验证。结果显示，该方法符合分析性能要求，具有特异性、线性响应、准确度（回收率在97.15~100.48%）和精密度（RSD＜5%）。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]图3: HPLC-CAD分析方法的验证

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为满足mRNA-LNP的方法开发和检测需求，耀海生物建立了适用的UHPLC-CAD分析方法，4种LNP组分实现基线分离，成功实现脂质组分的鉴别。各脂质组分定量检测符合线性关系（R2均大于0.99），该方法具有很好的重复性。

图4: LNP脂质组分鉴别与检测：耀海平台UHPLC-CAD三、结论

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]新冠疫情的爆发加速了mRNA疫苗技术的产业化，mRNA技术是生物制品的一大突破。与其他传统疫苗相比，mRNA疫苗具有安全性高、体液及细胞免疫双重机制、工艺平台化、研发周期短、低成本等诸多优点。mRNA技术应用场景广阔，预防性疫苗管线覆盖流感、RSV、CMV、HIV，治疗性疫苗/药物靶点包括肿瘤抗原、抗体、细胞因子、造血因子、干扰素、白介素、酶等，应用领域广阔。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在mRNA药物的产业化及临床应用的推动过程中，其质量研究方法是需要攻克的一大难关。在生产工艺开发及GMP生产的同时，需要有完整、灵敏、重复性好的分析方法做支持。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物质量研究服务平台，目前已具备针对30多种mRNA原液或LNP制剂成品质量属性的方法开发和检测能力。检测项目覆盖质粒纯度、超螺旋比例、浓度、杂质；mRNA原液完整性、加帽率、poly A尾分布、以及模板DNA、双链RNA（dsRNA）、T7 RNA聚合酶、加帽酶、2-O-甲基转移酶、DNAase I、内毒素、抗生素等工艺或产品相关杂质；LNP-mRNA成品包封率、粒径、Zeta电位、LNP组分与含量，可为 mRNA 疫苗与药物研发提供更准确、更快速、更灵敏的分析检测，全面满足客户项目研发需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）

参考文献

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Kim KH, Lee JE, Lee JC, Maharjan R, Oh H, Lee K, Kim NA, Jeong SH. Optimization of HPLCCAD method for simultaneous analysis of different lipids in lipid nanoparticles with analytical QbD. J Chromatogr A. 2023 Oct 25;1709:464375. doi: 10.1016/j.chroma.2023.464375.

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