2【耀文解读】纳米抗体/单域抗体“小材有大用”应用综述

耀海微生物cdmo

​1.2 重链抗体和纳米抗体结构简述

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在骆驼血清中发现存在特殊结构的IgG抗体，不存在 L 链，并且缺少重链的第一个恒定域 (CH1)，因此称为重链抗体。换句话说，它们的结构是同二聚体的。在其 N 端区域，同源二聚体蛋白的 H 链包含一个可变结构域，称为 VHH，用于与特异性抗原结合；随后是两个恒定结构域。HcAb 的抗原结合位点仅由一个通过铰链区直接连接到 Fc 结构域的单个结构域构成。同样，在鲨鱼血清中发现的重链抗体 (IgNAR) 也具有两条重链多肽的同源二聚体结构，每个重链多肽包含一个可变域和五个恒定域（同源二聚体结构）。尽管这些重链抗体缺少轻链，但是，它们表现出与常规抗体相似的高特异性和高多样性以及结合能力，HcAb 的大小 (75–90 kDa) 大约是传统抗体的一半，因此，其更小的尺寸和更紧凑的架构可能更适合结合隐匿的抗原表位。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2003年，源自骆驼科动物和软骨鱼重链抗体的可变区被称为纳米抗体，这是因为它们的尺寸较小，直径为 2.5 nm，高度为 4 nm，重量约为 12-15 kDa。相比之下，其他纳米抗体片段Fab片段分子量为57 kDa，单链可变片段 scFvs分子量为27KDa。纳米抗体通常具有意想不到的物理特性：在 > 4°C 和 < 20°C 具有更长的存放时间，耐受更高的温度（60–80°C，在 37°C 下数周），以及更加耐受蛋白酶降解，暴露于非生理性 pH（pH 范围 3.0-9.0）和化学变性剂（2-3 M 氯化胍、6-8 M 尿素）几乎不会损害其抗原结合能力。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]基于以上结构特性，纳米抗体表现出稳定性高、溶解度高、抗原结合活性高等理化生化性质，奠定了纳米抗体在医学领域广泛应用的基础。

图2: 抗体片段与纳米抗体结构示意图二、纳米抗体的体外制备

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]在抗体实际应用中，完整抗体的尺寸与其所需的某些功能不相容。因此，人们试图将抗体分子减少到能识别抗原的最小单位，这使得纳米抗体拥有巨大的市场需求。羊驼和鲨鱼的单域抗体分别称为VHH和VNAR。菌菌将以羊驼来源纳米抗体为例，分享纳米抗体的体外制备方法：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]第一步是抗原免疫。采用靶点抗原对羊驼进行免疫，免疫后抽取外周血，提取外周血中的淋巴细胞，抽提淋巴细胞溶液的总RNA，随后反转录为cDNA。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]第二步是纳米抗体筛选。以cDNA为模板，用特异性引物扩增出VHH基因序列，将VHH基因序列插入噬菌体载体中扩增，然后电转化到大肠杆菌感受态细胞中，得到纳米抗体展示文库。随后经过多重筛选抗原特异性克隆。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]最后是纳米抗体的重组表达。将已知的纳米抗体DNA序列插入表达载体中，在合适的宿主细胞，完成纳米抗体的体外制备。目前用于纳米抗体重组表达的宿主包括大肠杆菌、酵母、昆虫细胞、哺乳动物细胞等。其中大肠杆菌表达系统遗传操作简单，且生产工艺较为成熟、成本廉价，是大多数实验室和产业化阶段下纳米抗体重组表达的首选宿主。由于纳米抗体含特定的二硫键，在大肠杆菌中一般以可溶性蛋白形式表达于周质或细胞质，涉及的生产工艺包括：大肠杆菌发酵、诱导表达、菌体收集与破碎、可溶性蛋白纯化等。

图3: 羊驼纳米抗体制备示意图三、纳米抗体的医学应用3.1 分子诊断和检测

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体与荧光蛋白融合可用于超分辨率成像技术中的单分子定位。通过使用与荧光蛋白融合的纳米抗体，已经开发出一些示踪剂用于活细胞中的生物成像。这些“染色体”或“荧光体”可用于追踪活细胞中不同区室中的细胞内靶标，例如，靶向细胞骨架、核层形成和中间丝（如肌动蛋白）蛋白的“染色体”，靶向核因子的“染色体”等。源自纳米抗体的检测抗体包括放射性核苷酸标记的纳米抗体或荧光染料标记的纳米抗体、荧光蛋白融合纳米抗体、显色酶连接的二价纳米抗体、同源或异源多聚体基序介导的自组装纳米抗体，以及与涂层纳米颗粒相连的纳米抗体。此外，由于纳米抗体可设计用于诱导构象变化或区分构象变体，因此是监测蛋白质表达、易位和亚细胞定位的有效研究工具。

3.2 药物递送系统

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]纳米抗体附着在其他药物递送系统的表面，将包封在内的特异性药物主动靶向性递送到所需位置，主要用途包括：

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]&#376;用于癌症治疗的纳米抗体药物递送系统，可以将化疗药物、放射性核素、光敏剂、免疫调节剂等直接输送到肿瘤细胞或微环境，从而实现肿瘤的特异性杀伤或免疫激活。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]&#376;用于神经退行性疾病治疗的纳米抗体药物递送系统，可以将神经保护剂、基因编辑剂、干细胞等跨越血脑屏障，输送到受损的神经元或神经干细胞，从而实现神经功能的恢复或再生。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]&#376;用于感染性疾病治疗的纳米抗体药物递送系统，可以将抗生素、抗病毒剂、抗寄生虫剂等输送到感染部位或隐蔽部位，从而实现感染的清除或控制。

3.3 在癌症治疗中的应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]单克隆抗体是癌症研究和治疗的重要工具，靶向肿瘤细胞表面蛋白，通过阻断生长因子受体的信号传导或诱导细胞凋亡。通过调理肿瘤细胞，抗体还可以标记它们，使其受到补体系统、NK 细胞和巨噬细胞的攻击。然而，某些固有的结构特性限制了 mAb 在肿瘤治疗中的适用性。mAb 的大尺寸（四个多肽链，150 kDa）可能使接近肿瘤细胞变得困难。纳米抗体具备小分子和 mAbs 双重优势，因此，它们是开发新治疗策略的潜力药物。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]由于高间质压力，药物渗透到肿瘤中是通过扩散介导的。由于这个过程取决于分子大小，Nbs 比 mAbs 更能穿透肿瘤组织。另一方面，实体瘤的生长依赖于新血管的形成。目前，已经有研究者制备出了干扰新血管形成的纳米抗体。到目前为止，基于 Nbs 的疗法的潜在靶标是细胞外靶标，包括目标细胞中的配体受体或差异性表达的跨膜蛋白，例如靶向跨膜生长因子受体 1 型和 2 型（分别为 TGRF1 和 TGRF2）、血管内皮生长因子受体 (VEGFR)、酪氨酸激酶受体 (c-Met)和 7 型趋化因子受体 (CXCR7)等。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2022年10月17日，中国科学院上海药物研究所宫丽崑课题组、李佳课题组以及深圳大学靳广毅课题组合作开发了PD-L1/TLR7双靶向纳米抗体偶联药物（Nanobody drug conjugate，NDC）。TLR7 激动剂和 PD-L1 纳米抗体偶联形成双靶点 NDC 后，在“热”或“冷”肿瘤以及早期或晚期肿瘤模型中发挥协同抗肿瘤作用和安全性，重塑肿瘤免疫微环境并诱导抗肿瘤免疫记忆。经典抗体及其ADC由于其体积大，难以穿透实体瘤；纳米抗体偶联小分子激动剂很好地解决了经典抗体ADC的问题，开创了ADC新的方向领域；该研究为新型纳米抗体偶联药物的开发提供了夯实的理论依据和实验基础。

3.4 在预防病毒感染方面的应用

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]为对抗病毒并防止其传播，纳米抗体可以在病毒增殖周期的不同水平进行干扰，例如，通过阻止病毒与细胞结合、病毒进入细胞及其随后的复制。2020年，有研究者分离并表征了一种羊驼衍生的单域抗体 VHH 片段，命名为 Ty1，专门针对位于 SARS-CoV-2 刺突蛋白远端表面的球状结构域 (RBD)，直接阻止其与 ACE- 2的结合。Ty1 是一种 12.8 kDa 的纳米抗体，可以在细菌中大量表达，为其大规模生产提供了绝佳机会，并使其成为干预 COVID-19 的极佳候选药物。由于体积小和稳定性高，纳米抗体可能利用吸入器进行递送，从而使其成为治疗呼吸道病毒感染的极具吸引力的疗法。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]2022年12月27日，清华大学医学院张林琦教授、生命科学学院王新泉教授研究团队在Nature发表文章：《Broadly neutralizing and protective nanobodies against SARS-CoV-2 Omicron subvariants BA.1, BA.2, and BA.4/5 and diverse sarbecoviruses》，他们从免疫羊驼体内分离鉴定出纳米抗体，对SARS-CoV-2多种变异株、SARS-CoV-1和其他主要sarbecovirus病毒具有广谱高效中和活性。

四、小结

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]目前，全球已经有2款纳米抗体药物获批，分别为Ablynx开发的治疗罕见的凝血障碍米抗体药物Caplacizumab和三价纳米抗体Ozoralizumab。同时，有药企将纳米抗体与Fc结构域融合以延长半衰期，如康宁杰瑞的皮下注射PD-L1抗体恩沃利单抗（KN035）。另有递送纳米抗体基因的病毒载体获批用于细胞疗法，如传奇生物靶向BCMA的纳米抗体CAR-T疗法Ciltacabtagene autoleucel。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]相比传统的单克隆抗体药物（已获批药物达到一百多种），纳米抗体药物的开发仍然是一个较新的领域。Ablynx 在全球纳米抗体领域拥有绝对的领导地位，全球两款纳米抗体药物均由Ablynx开发。在国内，康宁杰瑞、晶准生物、洛启生物、深圳市国创纳米抗体技术公司、苏州博生吉 （安科）公司、江苏耀海生物、百英生物、阿帕克、康体生物等纷纷开拓纳米抗体市场。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]令人感到鼓舞的是，2022年，Market Research Future (MRFR) 的一份综合研究报告预计到 2030 年纳米抗体市场规模将达到 11.4 亿美元，复合年增长率为 24.2%，全球纳米抗体市场有望在未来几年得到迅速扩张。期待未来纳米抗体在基础研究和创新药研发领域能够大放异彩，有更多引人注目的成果诞生。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]利用DNA重组技术制备纳米抗体具有成本低、过程可控、批间稳定性高等优势。据耀海经验，纳米抗体在大肠杆菌、酵母中可实现高水平表达，基于微生物表达平台可有效缩短生产周期，降低生产成本。早期的工艺开发方面，纳米抗体打破了传统抗体的平台化工艺。纳米抗体不包含Fc等恒定区域，ProteinA等常规的亲和层析不再适用于纳米抗体的纯化。因此，需针对纳米抗体进行定制化工艺开发。

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)]耀海生物擅长有/无标签蛋白的定制化工艺开发。耀海团队全流程贯彻QbD理念，基于DoE高通量筛选发酵、纯化、制剂相关工艺参数或处方，可满足不同品类重组蛋白的表达量、纯度、杂质残留等定制化开发目标，同时高度契合生产放大需求。

耀海纳米抗体CDMO平台已成功交付多个项目，表达形式涵盖大肠杆菌周质表达、酵母胞外分泌表达等。我们交付的发酵和纯化工艺可满足高纯度、高活性样品的制备，高质量满足临床诊断或治疗需求。详情可咨询菌菌：13380332910（微信同号）。

参考文献

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][1] Pedreá&#241;ez A, Mosquera-Sulbarán J, Mu&#241;óz N, Tene D, Robalino J. Nanoantibodies: small molecules, big possibilities. BioTechnologia (Pozn). 2021 Sep 30;102(3):321-336. doi: 10.5114/bta.2021.108724

[color=rgba(0, 0, 0, 0.9)][2] Hamers-Casterman C, Atarhouch T, Muyldermans S, Robinson G, Hamers C, Songa EB, Bendahman N, Hamers R. Naturally occurring antibodies devoid of light chains. Nature. 1993 Jun 3;363(6428):446-8. doi: 10.1038/363446a0.

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